In Planta Genexpressie en genbewerking in Moso Bamboo Leaves
Summary
In deze studie werd een nieuwe methode voor planta-genexpressie en genbewerking ontwikkeld, gemedieerd door Agrobacterium , in bamboe. Deze methode verbeterde de efficiëntie van de validatie van genfuncties in bamboe aanzienlijk, wat aanzienlijke implicaties heeft voor het versnellen van het proces van bamboeveredeling.
Abstract
Voor bamboe is een nieuwe planta-gentransformatiemethode ontwikkeld, die de noodzaak van tijdrovende en arbeidsintensieve eeltinductie- en regeneratieprocessen vermijdt. Deze methode omvat Agrobacterium-gemedieerde genexpressie via wonden en vacuüm voor bamboezaailingen. Het toonde met succes de expressie aan van exogene genen, zoals de RUBY reporter en het Cas9-gen , in bamboebladeren. De hoogste transformatie-efficiëntie voor de accumulatie van betalaïne in RUBY-zaailingen werd bereikt met behulp van de GV3101-stam, met een percentage van 85,2% na infectie. Hoewel het vreemde DNA niet integreerde in het bamboegenoom, was de methode efficiënt in het tot expressie brengen van de exogene genen. Verder is er ook een genbewerkingssysteem ontwikkeld met een inheemse reporter die deze methode gebruikt, waaruit een in situ mutant gegenereerd door het bewerkte bamboe violaxanthine de-epoxidase gen (PeVDE) in bamboebladeren, met een mutatiesnelheid van 17,33%. De mutatie van PeVDE resulteerde in verlaagde niet-fotochemische afschrikkingswaarden (NPQ) bij veel licht, die nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd door een fluorometer. Dit maakt de bewerkte PeVDE een potentiële native reporter voor zowel exogene als endogene genen in bamboe. Met de verslaggever van PeVDE werd met succes een cinnamoyl-CoA-reductase-gen bewerkt met een mutatiesnelheid van 8,3%. Deze operatie vermijdt het proces van weefselkweek of eeltinductie, wat snel en efficiënt is voor het tot expressie brengen van exogene genen en endogene genbewerking in bamboe. Deze methode kan de efficiëntie van de verificatie van de genfunctie verbeteren en zal helpen bij het onthullen van de moleculaire mechanismen van belangrijke metabole routes in bamboe.
Introduction
Het onderzoek naar de genfunctie in bamboe is veelbelovend voor het geavanceerde begrip van bamboe en het ontsluiten van het potentieel voor genetische modificatie. Een effectieve manier hiervan kan worden bereikt door het proces van Agrobacterium-gemedieerde infectie in bamboebladeren, waarbij het T-DNA-fragment met exogene genen in de cellen wordt ingebracht, wat vervolgens leidt tot de expressie van de genen in de bladcellen.
Bamboe is een waardevolle en hernieuwbare grondstof met een breed scala aan toepassingen in productie, kunst en onderzoek. Bamboe heeft uitstekende houteigenschappen, zoals hoge mechanische sterkte, taaiheid, matige stijfheiden flexibiliteit1, die nu veel wordt gebruikt in een verscheidenheid aan huishoudelijke en industriële benodigdheden, waaronder tandenborstels, rietjes, knopen, wegwerpservies, ondergrondse pijpleidingen en koeltorenvullers voor thermische energieopwekking. Daarom speelt bamboeveredeling een cruciale rol bij het verkrijgen van bamboevariëteiten met uitstekende houteigenschappen voor het vervangen van kunststoffen en het verminderen van het gebruik van plastic, het beschermen van het milieu en het aanpakken van klimaatverandering, evenals het genereren van aanzienlijke economische waarde.
Traditionele bamboeveredeling staat echter voor uitdagingen vanwege de lange vegetatieve groeifase en de onzekere bloeiperiode. Hoewel er moleculaire veredelingstechnieken zijn ontwikkeld en toegepast op bamboeveredeling, is het proces van bamboegentransformatie tijdrovend, arbeidsintensief en gecompliceerd vanwege de eeltinductie- en regeneratieprocessen 2,3,4,5. Stabiele genetische transformatie vereist vaak Agrobacterium-gemedieerde methoden, waarbij weefselkweekprocessen zoals eeltinductie en regeneratie betrokken zijn. Bamboe heeft echter een laag vermogen tot eeltregeneratie, waardoor de toepassing van stabiele genetische transformatie in bamboe sterk wordt beperkt. Nadat Agrobacterium plantencellen heeft geïnfecteerd, komt het T-DNA-fragment de plantencellen binnen, waarbij de meeste T-DNA-fragmenten niet-geïntegreerd in de cellen blijven, wat resulteert in voorbijgaande expressie. Slechts een klein deel van de T-DNA-fragmenten integreert willekeurig in het chromosoom, wat leidt tot stabiele expressie. De voorbijgaande expressieniveaus vertonen een accumulatiecurve die kan variëren voor elk gen dat tot expressie wordt gebracht door een door Agrobacterium afgeleverd T-DNA. In de meeste gevallen treden de hoogste expressieniveaus 3-4 dagen na infiltratie op en nemen ze snel af na 5-6 dagen 6,7. Eerdere studies hebben aangetoond dat meer dan 1/3e van de mutaties in gen-bewerkte planten verkregen zonder selectiedruk voor resistentie afkomstig is van de voorbijgaande expressie van CRISPR/Cas9, terwijl de resterende minder dan 2/3e afkomstig is van stabiele expressie na DNA-integratie in het genoom8. Dit geeft aan dat T-DNA-integratie in het plantengenoom niet nodig is voor genbewerking. Bovendien remt selectiedruk voor resistentie de groei van niet-transgene cellen aanzienlijk, wat het regeneratieproces van geïnfecteerde explantaten rechtstreeks beïnvloedt. Daarom is het, door gebruik te maken van voorbijgaande expressie zonder selectiedruk voor resistentie in bamboe, mogelijk om niet-geïntegreerde expressie van exogene genen te bereiken en de genfunctie rechtstreeks in plantenorganen te bestuderen. Daarom kan een eenvoudige en tijdbesparende methode worden ontwikkeld voor exogene genexpressie en -bewerking in bamboe9.
De ontwikkelde exogene genexpressie- en genbewerkingsmethode wordt gekenmerkt door zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en de afwezigheid van dure apparatuur of complexe procedures9. Bij deze methode werd het bamboe-endogene violaxanthine de-epoxidase-gen (PeVDE) gebruikt als verslaggever voor exogene genexpressie zonder selectiedruk. Dit komt omdat de bewerkte PeVDE in bamboebladeren het fotobeschermingsvermogen bij veel licht vermindert en een afname van de niet-fotochemische afschrikking (NPQ)-waarde vertoont, die kan worden gedetecteerd door middel van chlorofylfluorescentiebeeldvorming. Om de effectiviteit van deze methode aan te tonen, werd een ander bamboe-endogeen gen, het cinnamoyl-CoA-reductase-gen (PeCCR5)9, uitgeschakeld met behulp van dit systeem en genereerde met succes mutanten van dit gen. Deze techniek kan worden gebruikt voor de functionele karakterisering van genen die functies hebben in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe. Deze techniek kan worden toegepast op de functionele karakterisering van genen die functioneren in bamboebladeren. Door deze genen tijdelijk tot overexpressie te brengen in bamboebladeren, kunnen hun expressieniveaus worden verhoogd, of door genbewerking kan hun expressie worden verlaagd, waardoor stroomafwaartse genexpressieniveaus, bladfenotypes en productinhoud kunnen worden bestudeerd. Bovendien is het belangrijk op te merken dat, als gevolg van uitgebreide polyploïdisatie, de meerderheid van commercieel belangrijke genen in bamboegenomen aanwezig zijn in meerdere kopieën, wat resulteert in genetische redundantie. Dit vormt een uitdaging voor het uitvoeren van multiplex genoombewerking in bamboe. Voorafgaand aan de toepassing van stabiele genetische transformatie- of genbewerkingstechnieken is het van cruciaal belang om genfuncties snel te valideren. Bij het aanpakken van het probleem van meerdere genkopieën, is een benadering het analyseren van transcriptoomexpressieprofielen om genen te identificeren die actief tot expressie worden gebracht tijdens specifieke stadia. Bovendien maakt het richten op de geconserveerde functionele domeinen van deze genkopieën het mogelijk om gemeenschappelijke doelsequenties te ontwerpen of meerdere doellocaties in dezelfde CRISPR/Cas9-vector op te nemen, waardoor deze genen gelijktijdig kunnen worden uitgeschakeld. Dit zorgt voor een efficiëntere en haalbaardere aanpak voor genfunctieonderzoek in bamboe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode vermindert de benodigde tijd aanzienlijk in vergelijking met traditionele genetische transformatiemethoden, die doorgaans 1-2 jaar duren, en bereikt voorbijgaande expressie van exogene genen en genbewerking van endogene genen binnen 5 dagen. Deze methode heeft echter beperkingen omdat het slechts een klein deel van de cellen kan transformeren, en de gen-bewerkte bladeren zijn chimeer en missen het vermogen om te regenereren tot complete planten. Desalniettemin biedt deze technologie voor genexpressie en genb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) bedanken voor de financiële steun.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
Referências
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
