À Planta Expression génique et édition de gènes dans les feuilles de bambou moso
Summary
Dans cette étude, une nouvelle méthode d’expression génique in planta et d’édition de gènes médiée par Agrobacterium a été développée dans le bambou. Cette méthode a grandement amélioré l’efficacité de la validation de la fonction génique chez le bambou, ce qui a des implications importantes pour accélérer le processus de sélection du bambou.
Abstract
Une nouvelle méthode de transformation génique in planta a été développée pour le bambou, ce qui évite d’avoir recours à des processus d’induction et de régénération des callosités longs et laborieux. Cette méthode implique l’expression génique médiée par Agrobacterium par blessure et vide pour les semis de bambou. Il a démontré avec succès l’expression de gènes exogènes, tels que le rapporteur RUBY et le gène Cas9 , dans les feuilles de bambou. L’efficacité de transformation la plus élevée pour l’accumulation de bétalaïne dans les plantules RUBY a été obtenue en utilisant la souche GV3101, avec un pourcentage de 85,2 % après l’infection. Bien que l’ADN étranger ne se soit pas intégré dans le génome du bambou, la méthode s’est avérée efficace pour exprimer les gènes exogènes. De plus, un système d’édition de gènes a également été développé avec un rapporteur natif utilisant cette méthode, à partir duquel un mutant in situ généré par le gène modifié de la violaxanthine dé-époxydase du bambou (PeVDE) dans les feuilles de bambou, avec un taux de mutation de 17,33%. La mutation de PeVDE a entraîné une diminution des valeurs d’extinction non photochimique (NPQ) sous une forte luminosité, qui peut être détectée avec précision par un fluorimètre. Cela fait du PeVDE édité un rapporteur natif potentiel pour les gènes exogènes et endogènes du bambou. Avec le rapporteur de PeVDE, un gène de la cinnamoyl-CoA réductase a été édité avec succès avec un taux de mutation de 8,3%. Cette opération permet d’éviter le processus de culture tissulaire ou d’induction de callosités, qui est rapide et efficace pour l’expression de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes chez le bambou. Cette méthode peut améliorer l’efficacité de la vérification de la fonction des gènes et aidera à révéler les mécanismes moléculaires des principales voies métaboliques du bambou.
Introduction
L’étude de la fonction des gènes chez le bambou est très prometteuse pour la compréhension avancée du bambou et la libération de son potentiel de modification génétique. Un moyen efficace d’y parvenir peut être réalisé par le processus d’infection médiée par Agrobacterium dans les feuilles de bambou, par lequel le fragment d’ADN-T contenant des gènes exogènes est introduit dans les cellules, conduisant ensuite à l’expression des gènes dans les cellules foliaires.
Le bambou est une ressource précieuse et renouvelable avec un large éventail d’applications dans la fabrication, l’art et la recherche. Le bambou possède d’excellentes propriétés du bois telles qu’une résistance mécanique élevée, une ténacité, une rigidité modérée et une flexibilité1, qui est maintenant largement utilisée dans une variété de fournitures domestiques et industrielles, y compris les brosses à dents, les pailles, les boutons, la vaisselle jetable, les pipelines souterrains et les remplissages de tours de refroidissement pour la production d’énergie thermique. Par conséquent, la sélection du bambou joue un rôle crucial dans l’obtention de variétés de bambou avec d’excellentes propriétés de bois pour remplacer les plastiques et réduire l’utilisation du plastique, protéger l’environnement et lutter contre le changement climatique, ainsi que générer une valeur économique importante.
Cependant, la sélection traditionnelle du bambou est confrontée à des défis en raison de la longue phase de croissance végétative et de la période de floraison incertaine. Bien que des techniques de sélection moléculaire aient été développées et appliquées à la sélection du bambou, le processus de transformation des gènes du bambou est long, laborieux et compliqué en raison des processus d’induction et de régénération des callosités 2,3,4,5. La transformation génétique stable nécessite souvent des méthodes médiées par Agrobacterium, qui impliquent des processus de culture tissulaire tels que l’induction et la régénération des callosités. Cependant, le bambou a une faible capacité de régénération des callosités, ce qui limite considérablement l’application d’une transformation génétique stable dans le bambou. Une fois qu’Agrobacterium a infecté les cellules végétales, le fragment d’ADN-T pénètre dans les cellules végétales, la majorité des fragments d’ADN-T restant non intégrés dans les cellules, ce qui entraîne une expression transitoire. Seule une petite partie des fragments d’ADN-T s’intègre de manière aléatoire dans son chromosome, ce qui conduit à une expression stable. Les niveaux d’expression transitoire montrent une courbe d’accumulation qui peut varier pour chaque gène exprimé à partir d’un ADN-T délivré par Agrobacterium. Dans la plupart des cas, les niveaux d’expression les plus élevés se produisent 3 à 4 jours après l’infiltration et diminuent rapidement après 5 à 6 jours 6,7. Des études antérieures ont montré que plus d’1/3 des mutations chez les plantes génétiquement modifiées obtenues sans pression de sélection pour la résistance proviennent de l’expression transitoire de CRISPR/Cas9, tandis que les 2/3 restants proviennent d’une expression stable après intégration de l’ADN dans le génome8. Cela indique que l’intégration de l’ADN-T dans le génome de la plante n’est pas nécessaire pour l’édition de gènes. De plus, la pression de sélection pour la résistance inhibe considérablement la croissance des cellules non transgéniques, affectant directement le processus de régénération des explants infectés. Par conséquent, en utilisant l’expression transitoire sans pression de sélection pour la résistance chez le bambou, il est possible d’obtenir une expression non intégrée de gènes exogènes et d’étudier la fonction des gènes directement dans les organes végétaux. Par conséquent, une méthode simple et rapide peut être développée pour l’expression et l’édition de gènes exogènes dans le bambou9.
La méthode d’expression génique exogène et d’édition de gènes développée se caractérise par sa simplicité, son rapport coût-efficacité et l’absence d’équipements coûteux ou de procédures complexes9. Dans cette méthode, le gène de la violaxanthine désépoxydase endogène du bambou (PeVDE) a été utilisé comme rapporteur pour l’expression des gènes exogènes sans pression de sélection. En effet, le PeVDE modifié dans les feuilles de bambou réduit la capacité de photoprotection sous une lumière élevée et démontre une diminution de la valeur d’extinction non photochimique (NPQ), qui peut être détectée par imagerie par fluorescence chlorophyllienne. Pour démontrer l’efficacité de cette méthode, un autre gène endogène du bambou, le gène de la cinnamoyl-CoA réductase (PeCCR5)9, a été éliminé à l’aide de ce système et a généré avec succès des mutants de ce gène. Cette technique peut être utilisée pour la caractérisation fonctionnelle des gènes qui ont des fonctions dans les feuilles de bambou. En surexprimant ces gènes de manière transitoire dans les feuilles de bambou, leurs niveaux d’expression peuvent être améliorés, ou par l’édition de gènes, leur expression peut être réduite, ce qui permet d’étudier les niveaux d’expression génique en aval, les phénotypes des feuilles et le contenu du produit. Cela fournit une approche plus efficace et plus réalisable pour la recherche sur la fonction des gènes chez le bambou. Cette technique peut être appliquée à la caractérisation fonctionnelle des gènes qui fonctionnent dans les feuilles de bambou. En surexprimant ces gènes de manière transitoire dans les feuilles de bambou, leurs niveaux d’expression peuvent être améliorés, ou par l’édition de gènes, leur expression peut être réduite, ce qui permet d’étudier les niveaux d’expression génique en aval, les phénotypes des feuilles et le contenu du produit. De plus, il est important de noter qu’en raison d’une polyploïdisation étendue, la majorité des gènes commercialement importants dans les génomes du bambou sont présents en plusieurs copies, ce qui entraîne une redondance génétique. Cela pose un défi pour l’édition multiplex du génome dans le bambou. Avant d’appliquer des techniques de transformation génétique stable ou d’édition de gènes, il est crucial de valider rapidement les fonctions des gènes. Pour résoudre le problème des copies multiples de gènes, une approche consiste à analyser les profils d’expression du transcriptome afin d’identifier les gènes qui sont activement exprimés à des stades spécifiques. De plus, le ciblage des domaines fonctionnels conservés de ces copies de gènes permet la conception de séquences cibles communes ou l’incorporation de plusieurs sites cibles dans le même vecteur CRISPR/Cas9, ce qui permet l’élimination simultanée de ces gènes. Cela fournit une approche plus efficace et plus réalisable pour la recherche sur la fonction des gènes chez le bambou.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode réduit considérablement le temps nécessaire par rapport aux méthodes de transformation génétique traditionnelles, qui prennent généralement 1 à 2 ans, et permet d’obtenir l’expression transitoire de gènes exogènes et l’édition de gènes endogènes en 5 jours. Cependant, cette méthode a des limites car elle ne peut transformer qu’une petite proportion de cellules, et les feuilles génétiquement modifiées sont chimériques et n’ont pas la capacité de se régénérer en plantes compl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Programme national clé de recherche et de développement de la Chine (subvention n° 2021YFD2200502), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31971736) pour le soutien financier.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
Referências
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