प्लांटा में। मोसो बांस की पत्तियों में जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन
Summary
इस अध्ययन में, बांस में एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता में प्लांटा जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन विधि में एक उपन्यास विकसित किया गया था। इस विधि ने बांस में जीन फ़ंक्शन सत्यापन की दक्षता में काफी सुधार किया, जिसमें बांस प्रजनन की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।
Abstract
बांस के लिए प्लांटा जीन परिवर्तन विधि में एक नया विकसित किया गया था, जो समय लेने वाली और श्रम-गहन कैलस प्रेरण और पुनर्जनन प्रक्रियाओं की आवश्यकता से बचता है। इस विधि में बांस के पौधों के लिए घाव और वैक्यूम के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति शामिल है। इसने बांस के पत्तों में बहिर्जात जीन, जैसे रूबी रिपोर्टर और कैस 9 जीन की अभिव्यक्ति का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया। रूबी रोपाई में बीटालेन के संचय के लिए उच्चतम परिवर्तन दक्षता जीवी 3101 तनाव का उपयोग करके हासिल की गई थी, जिसमें संक्रमण के बाद 85.2% का प्रतिशत था। हालांकि विदेशी डीएनए बांस जीनोम में एकीकृत नहीं था, लेकिन विधि बहिर्जात जीन को व्यक्त करने में कुशल थी। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग करके एक देशी रिपोर्टर के साथ एक जीन संपादन प्रणाली भी विकसित की गई है, जिसमें से बांस के पत्तों में संपादित बांस वायोलाक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन (पीईवीडीई) द्वारा उत्पन्न एक सीटू उत्परिवर्ती, 17.33% की उत्परिवर्तन दर के साथ। पीईवीडीई के उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप उच्च प्रकाश के तहत गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मूल्यों में कमी आई, जिसे फ्लोरोमीटर द्वारा सटीक रूप से पता लगाया जा सकता है। यह संपादित पीईवीडीई को बांस में बहिर्जात और अंतर्जात जीन दोनों के लिए एक संभावित देशी रिपोर्टर बनाता है। पीईवीडीई के रिपोर्टर के साथ, एक सिनामॉयल-सीओए रिडक्टेस जीन को 8.3% की उत्परिवर्तन दर के साथ सफलतापूर्वक संपादित किया गया था। यह ऑपरेशन ऊतक संवर्धन या कैलस प्रेरण की प्रक्रिया से बचता है, जो बांस में बहिर्जात जीन और अंतर्जात जीन संपादन को व्यक्त करने के लिए त्वरित और कुशल है। यह विधि जीन फ़ंक्शन सत्यापन की दक्षता में सुधार कर सकती है और बांस में प्रमुख चयापचय मार्गों के आणविक तंत्र को प्रकट करने में मदद करेगी।
Introduction
बांस में जीन फ़ंक्शन की जांच बांस की उन्नत समझ और आनुवंशिक संशोधन के लिए इसकी क्षमता को अनलॉक करने के लिए बहुत वादा करती है। इसका एक प्रभावी तरीका बांस के पत्तों में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता संक्रमण की प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे बहिर्जात जीन युक्त टी-डीएनए टुकड़ा कोशिकाओं में पेश किया जाता है, बाद में पत्ती कोशिकाओं के भीतर जीन की अभिव्यक्ति होती है।
बांस विनिर्माण, कला और अनुसंधान में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक मूल्यवान और नवीकरणीय संसाधन है। बांस में उच्च यांत्रिक शक्ति, क्रूरता, मध्यम कठोरता और लचीलापन1 जैसे उत्कृष्ट लकड़ी के गुण होते हैं, जो अब विभिन्न प्रकार की घरेलू और औद्योगिक आपूर्ति में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें टूथब्रश, स्ट्रॉ, बटन, डिस्पोजेबल टेबलवेयर, भूमिगत पाइपलाइन और थर्मल पावर उत्पादन के लिए कूलिंग टॉवर फिलर्स शामिल हैं। इसलिए, प्लास्टिक को बदलने और प्लास्टिक के उपयोग को कम करने, पर्यावरण की रक्षा करने और जलवायु परिवर्तन से निपटने के साथ-साथ महत्वपूर्ण आर्थिक मूल्य उत्पन्न करने के लिए उत्कृष्ट लकड़ी के गुणों के साथ बांस की किस्मों को प्राप्त करने में बांस प्रजनन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
हालांकि, पारंपरिक बांस प्रजनन को लंबे वनस्पति विकास चरण और अनिश्चित फूलों की अवधि के कारण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। यद्यपि आणविक प्रजनन तकनीकों को विकसित किया गया है और बांस प्रजनन पर लागू किया गया है, बांस जीन परिवर्तन की प्रक्रिया समय लेने वाली, श्रम-गहन और कैलस प्रेरण और पुनर्जननप्रक्रियाओं 2,3,4,5 के कारण जटिल है। स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के लिए अक्सर एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता विधियों की आवश्यकता होती है, जिसमें कैलस प्रेरण और पुनर्जनन जैसी ऊतक संवर्धन प्रक्रियाएं शामिल होती हैं। हालांकि, बांस में कैलस पुनर्जनन की कम क्षमता होती है, जो बांस में स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन के आवेदन को बहुत सीमित करती है। एग्रोबैक्टीरियम पौधों की कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद, टी-डीएनए टुकड़ा पौधे की कोशिकाओं में प्रवेश करता है, जिसमें अधिकांश टी-डीएनए टुकड़े कोशिकाओं में गैर-एकीकृत रहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक अभिव्यक्ति होती है। टी-डीएनए टुकड़ों का केवल एक छोटा सा हिस्सा यादृच्छिक रूप से अपने गुणसूत्र में एकीकृत होता है, जिससे स्थिर अभिव्यक्ति होती है। क्षणिक अभिव्यक्ति स्तर एक संचय वक्र दिखाते हैं जो एग्रोबैक्टीरियम-वितरित टी-डीएनए से व्यक्त प्रत्येक जीन के लिए भिन्न हो सकता है। ज्यादातर मामलों में, उच्चतम अभिव्यक्ति स्तर घुसपैठ के 3-4 दिन बाद होता है और 5-6 दिनों के बाद जल्दी से कम होजाता है 6,7। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रतिरोध के लिए चयन दबाव के बिना प्राप्त जीन-संपादित पौधों में 1/3 से अधिक उत्परिवर्तन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 की क्षणिक अभिव्यक्ति से आते हैं, जबकि शेष 2/3 से कम जीनोम8 में डीएनए एकीकरण के बाद स्थिर अभिव्यक्ति से आते हैं। यह इंगित करता है कि जीन संपादन के लिए पौधे जीनोम में टी-डीएनए एकीकरण आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, प्रतिरोध के लिए चयन दबाव गैर-ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के विकास को काफी हद तक रोकता है, सीधे संक्रमित खोजों की पुनर्जनन प्रक्रिया को प्रभावित करता है। इसलिए, बांस में प्रतिरोध के लिए चयन दबाव के बिना क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके, बहिर्जात जीन की गैर-एकीकृत अभिव्यक्ति प्राप्त करना और पौधे के अंगों में सीधे जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करना संभव है। इसलिए, बांस9 में बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति और संपादन के लिए एक आसान और समय की बचत विधि विकसित की जा सकती है।
विकसित बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति और जीन संपादन विधि को इसकी सादगी, लागत-प्रभावशीलता और महंगे उपकरण याजटिल प्रक्रियाओं की अनुपस्थिति की विशेषता है। इस विधि में, बांस अंतर्जात वियोलैक्सैंथिन डी-एपोऑक्सीडेज जीन (पीईवीडीई) का उपयोग चयन दबाव के बिना बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति के लिए रिपोर्टर के रूप में किया गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि बांस के पत्तों में संपादित पीईवीडीई उच्च प्रकाश के तहत फोटोप्रोटेक्शन क्षमता को कम करता है और गैर-फोटोकैमिकल शमन (एनपीक्यू) मूल्य में कमी को दर्शाता है, जिसे क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। इस पद्धति की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, एक और बांस अंतर्जात जीन, सिनामॉयल-सीओए रिडक्टेस जीन (पेसीसीआर 5)9, को इस प्रणाली का उपयोग करके बाहर कर दिया गया और सफलतापूर्वक इस जीन के उत्परिवर्ती उत्पन्न हुए। इस तकनीक का उपयोग उन जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है जिनके बांस के पत्तों में कार्य होते हैं। बांस की पत्तियों में इन जीनों को क्षणिक रूप से अतिरंजित करके, उनकी अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाया जा सकता है, या जीन संपादन द्वारा, उनकी अभिव्यक्ति को नीचे गिराया जा सकता है, जिससे डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति स्तर, पत्ती फेनोटाइप और उत्पाद सामग्री के अध्ययन की अनुमति मिलती है। यह बांस में जीन फ़ंक्शन अनुसंधान के लिए एक अधिक कुशल और व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस तकनीक को बांस के पत्तों में कार्य करने वाले जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है। बांस की पत्तियों में इन जीनों को क्षणिक रूप से अतिरंजित करके, उनकी अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाया जा सकता है, या जीन संपादन द्वारा, उनकी अभिव्यक्ति को नीचे गिराया जा सकता है, जिससे डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति स्तर, पत्ती फेनोटाइप और उत्पाद सामग्री के अध्ययन की अनुमति मिलती है। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, व्यापक पॉलीप्लोइडाइजेशन के कारण, बांस जीनोम में व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण जीन के बहुमत कई प्रतियों में मौजूद होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आनुवंशिक अतिरेक होता है। यह बांस में मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन करने के लिए एक चुनौती है। स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन या जीन संपादन तकनीकों के आवेदन से पहले, जीन कार्यों को जल्दी से मान्य करना महत्वपूर्ण है। कई जीन प्रतियों के मुद्दे को संबोधित करने में, एक दृष्टिकोण विशिष्ट चरणों के दौरान सक्रिय रूप से व्यक्त किए जाने वाले जीन की पहचान करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टम अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करना है। इसके अलावा, इन जीन प्रतियों के संरक्षित कार्यात्मक डोमेन को लक्षित करने से सामान्य लक्ष्य अनुक्रमों के डिजाइन या एक ही सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 वेक्टर में कई लक्ष्य साइटों को शामिल करने की अनुमति मिलती है, जिससे इन जीनों के एक साथ नॉकआउट को सक्षम किया जा सकता है। यह बांस में जीन फ़ंक्शन अनुसंधान के लिए एक अधिक कुशल और व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि पारंपरिक आनुवंशिक परिवर्तन विधियों की तुलना में आवश्यक समय को काफी कम कर देती है, जिसमें आमतौर पर 1-2 साल लगते हैं, और 5 दिनों के भीतर बहिर्जात जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति और अंतर्जात जीन के जीन संपाद?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वित्तीय सहायता के लिए चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2021 वाईएफडी 2200502), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31971736) को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
Referências
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