I Planta Genuttryck och genredigering i Moso bambublad
Summary
I denna studie utvecklades en ny metod för planta-genuttryck och genredigering som medierats av Agrobacterium i bambu. Denna metod förbättrade avsevärt effektiviteten av genfunktionsvalidering i bambu, vilket har betydande konsekvenser för att påskynda processen för bambuförädling.
Abstract
En ny metod för gentransformation av planta har utvecklats för bambu, vilket gör att man slipper behovet av tidskrävande och arbetsintensiva processer för induktion och regenerering av förhårdnader. Denna metod involverar Agrobacterium-medierat genuttryck via sår och vakuum för bambuplantor. Den visade framgångsrikt uttrycket av exogena gener, såsom RUBY-reportern och Cas9-genen , i bambublad. Den högsta omvandlingseffektiviteten för ackumulering av betalain i RUBY-plantor uppnåddes med hjälp av GV3101-stammen, med en procentandel på 85,2 % efter infektion. Även om det främmande DNA:t inte integrerades i bambugenomet var metoden effektiv när det gällde att uttrycka de exogena generna. Dessutom har ett genredigeringssystem också utvecklats med en infödd reporter som använder denna metod, från vilken en in situ-mutant genereras av den redigerade bambuviolaxantinde-epoxidasgenen (PeVDE) i bambublad, med en mutationshastighet på 17,33%. Mutationen av PeVDE resulterade i minskade värden för icke-fotokemisk kylning (NPQ) under starkt ljus, vilket kan detekteras exakt med en fluorometer. Detta gör den redigerade PeVDE till en potentiell infödd rapportör för både exogena och endogena gener i bambu. Med reportern av PeVDE redigerades framgångsrikt en cinnamoyl-CoA-reduktasgen med en mutationshastighet på 8,3 %. Denna operation undviker processen med vävnadsodling eller induktion av förhårdnader, vilket är snabbt och effektivt för att uttrycka exogena gener och endogen genredigering i bambu. Denna metod kan förbättra effektiviteten av verifiering av genfunktioner och kommer att hjälpa till att avslöja de molekylära mekanismerna för viktiga metaboliska vägar i bambu.
Introduction
Undersökningen av genfunktionen i bambu är mycket lovande för den avancerade förståelsen av bambu och för att låsa upp dess potential för genetisk modifiering. Ett effektivt sätt att uppnå detta kan uppnås genom processen med Agrobacterium-medierad infektion i bambublad, varigenom T-DNA-fragmentet som innehåller exogena gener förs in i cellerna, vilket därefter leder till att generna uttrycks i bladcellerna.
Bambu är en värdefull och förnybar resurs med ett brett användningsområde inom tillverkning, konst och forskning. Bambu har utmärkta träegenskaper såsom hög mekanisk hållfasthet, seghet, måttlig styvhet och flexibilitet1, som nu används i stor utsträckning i en mängd olika hushålls- och industriförnödenheter, inklusive tandborstar, sugrör, knappar, engångsserviser, underjordiska rörledningar och kyltornsfyllmedel för termisk kraftproduktion. Därför spelar bambuförädling en avgörande roll för att få fram bambusorter med utmärkta träegenskaper för att ersätta plast och minska plastanvändningen, skydda miljön och ta itu med klimatförändringarna, samt generera betydande ekonomiskt värde.
Traditionell bambuförädling står dock inför utmaningar på grund av det långa vegetativa tillväxtstadiet och den osäkra blomningsperioden. Även om molekylära förädlingstekniker har utvecklats och tillämpats på bambuförädling, är processen för bambugentransformation tidskrävande, arbetsintensiv och komplicerad på grund av kallusinduktions- och regenereringsprocesserna 2,3,4,5. Stabil genetisk transformation kräver ofta Agrobacterium-medierade metoder, som involverar vävnadsodlingsprocesser som induktion och regenerering av förhårdnader. Bambu har dock en låg förmåga till regenerering av förhårdnader, vilket kraftigt begränsar tillämpningen av stabil genetisk transformation i bambu. Efter att Agrobacterium infekterat växtceller kommer T-DNA-fragmentet in i växtcellerna, och majoriteten av T-DNA-fragmenten förblir icke-integrerade i cellerna, vilket resulterar i övergående uttryck. Endast en liten del av T-DNA-fragmenten integreras slumpmässigt i kromosomen, vilket leder till ett stabilt uttryck. De transienta uttrycksnivåerna visar en ackumuleringskurva som kan variera för varje gen som uttrycks från ett T-DNA som levereras av Agrobacterium. I de flesta fall uppträder de högsta uttrycksnivåerna 3-4 dagar efter infiltration och minskar snabbt efter 5-6 dagar 6,7. Tidigare studier har visat att mer än 1/3 av mutationerna i genredigerade växter som erhålls utan selektionstryck för resistens kommer från det övergående uttrycket av CRISPR/Cas9, medan de återstående mindre än 2/3 kommer från stabilt uttryck efter DNA-integration i genomet8. Detta indikerar att T-DNA-integration i växtgenomet inte är nödvändig för genredigering. Dessutom hämmar selektionstrycket för resistens avsevärt tillväxten av icke-transgena celler, vilket direkt påverkar regenereringsprocessen hos infekterade explantat. Därför, genom att använda transient uttryck utan selektionstryck för resistens i bambu, är det möjligt att uppnå icke-integrerat uttryck av exogena gener och studera genfunktion direkt i växtorgan. Därför kan en enkel och tidsbesparande metod utvecklas för exogent genuttryck och redigering i bambu9.
Den utvecklade exogena genuttrycks- och genredigeringsmetoden kännetecknas av sin enkelhet, kostnadseffektivitet och frånvaron av dyr utrustning eller komplexa procedurer9. I denna metod användes den endogena violaxantin-epoxidasgenen (PeVDE) för exogent genuttryck utan selektionstryck. Detta beror på att den redigerade PeVDE i bambublad minskar ljusskyddsförmågan under starkt ljus och visar en minskning av det icke-fotokemiska släckningsvärdet (NPQ), vilket kan detekteras genom klorofyllfluorescensavbildning. För att demonstrera effektiviteten av denna metod slogs en annan endogen gen av bambu, cinnamoyl-CoA-reduktasgenen (PeCCR5)9, ut med hjälp av detta system och genererade framgångsrikt mutanter av denna gen. Denna teknik kan användas för funktionell karakterisering av gener som har funktioner i bambublad. Genom att överuttrycka dessa gener tillfälligt i bambublad kan deras uttrycksnivåer förbättras, eller genom genredigering kan deras uttryck slås ner, vilket möjliggör studier av nedströms genuttrycksnivåer, bladfenotyper och produktinnehåll. Detta ger ett mer effektivt och genomförbart tillvägagångssätt för forskning om genfunktioner i bambu. Denna teknik kan tillämpas på funktionell karakterisering av gener som fungerar i bambublad. Genom att överuttrycka dessa gener tillfälligt i bambublad kan deras uttrycksnivåer förbättras, eller genom genredigering kan deras uttryck slås ner, vilket möjliggör studier av nedströms genuttrycksnivåer, bladfenotyper och produktinnehåll. Dessutom är det viktigt att notera att på grund av omfattande polyploidisering finns majoriteten av kommersiellt viktiga gener i bambugenom i flera kopior, vilket resulterar i genetisk redundans. Detta utgör en utmaning för att utföra multiplex genomredigering i bambu. Innan man tillämpar stabil genetisk transformation eller genredigeringstekniker är det viktigt att snabbt validera genfunktioner. För att ta itu med problemet med multipla genkopior är ett tillvägagångssätt att analysera transkriptomuttrycksprofiler för att identifiera gener som uttrycks aktivt under specifika stadier. Att rikta in sig på de bevarade funktionella domänerna för dessa genkopior gör det dessutom möjligt att utforma gemensamma målsekvenser eller införliva flera målplatser i samma CRISPR/Cas9-vektor, vilket möjliggör samtidig knockout av dessa gener. Detta ger ett mer effektivt och genomförbart tillvägagångssätt för forskning om genfunktioner i bambu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod minskar avsevärt tidsåtgången jämfört med traditionella genetiska transformationsmetoder, som vanligtvis tar 1-2 år, och uppnår övergående uttryck av exogena gener och genredigering av endogena gener inom 5 dagar. Denna metod har dock begränsningar eftersom den bara kan omvandla en liten del av cellerna, och de genredigerade bladen är chimära och saknar förmåga att regenerera till kompletta plantor. Icke desto mindre ger detta i planta-genuttryck och genredigeringsteknik ett kraftfullt tillväga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) för det ekonomiska stödet.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
Referências
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
