Denne protokollen presenterer en integrert biorepository-plattform for standardisert innsamling, merknad og biobanking av høykvalitets human vandig humor og glassaktige flytende biopsier for molekylære nedstrømsanalyser, inkludert proteomikk, metabolomikk og glykomikk.
En kritisk utfordring i translasjonsforskning er å etablere et levedyktig og effektivt grensesnitt mellom pasientbehandling i operasjonssalen (OR) og forskningslaboratoriet. Her utviklet vi en protokoll for innhenting av flytende biopsier av høy kvalitet for molekylære analyser fra vannhumor og glasslegemet fra pasienter som gjennomgår øyekirurgi. I denne arbeidsflyten brukes en Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI)-vogn utstyrt med en datamaskin, en strekkodeskanner og laboratorieinstrumenter, inkludert kjølelager ombord, til å innhente og arkivere humane biologiske prøver. En nettbasert database som er kompatibel med personvern gjør det mulig å kommentere hver prøve i løpet av levetiden, og et kartesisk koordinatsystem gjør det mulig å spore hvert strekkodede eksemplar som er lagret, noe som muliggjør rask og nøyaktig henting av prøver for nedstrømsanalyser. Molekylær karakterisering av humane vevsprøver tjener ikke bare som et diagnostisk verktøy (for eksempel for å skille mellom infeksiøs endoftalmitt og annen ikke-smittsom intraokulær betennelse), men representerer også en viktig komponent i translasjonsforskning, som gjør det mulig å identifisere nye legemiddelmål, utvikling av nye diagnostiske verktøy og personlig terapi.
Molekylær profilering av flytende biopsier fra det menneskelige øye kan fange lokalt berikede væsker som inneholder molekyler som DNA, RNA, proteiner, glykaner og metabolitter fra høyt spesialiserte okulære vev. Flytende biopsier fra glasslegemet i det bakre kammer i det menneskelige øye viste seg å være en generelt sikker prosedyre1. De tillater molekylær karakterisering av okulære sykdommer hos levende mennesker og gir potensial til å identifisere nye diagnostiske og terapeutiske strategier 2,3,4. Den vandige humor i øyets fremre kammer har enda høyere kirurgisk tilgjengelighet og kan oppnås i stort antall, for eksempel under kataraktkirurgi, som er en av de hyppigst utførte operasjonene. Imidlertid er ingen standardisert protokoll for innsamling, merknad og biobanking av humant vandig humor og glasslegemebiopsier for molekylære nedstrømsanalyser, inkludert proteomikk, metabolomikk og glykomikk, tilgjengelig til nå.
Her utviklet vi en protokoll for innsamling og biobanking av flytende biopsier av høy kvalitet for molekylære analyser fra pasienter som gjennomgår øyekirurgi. Et Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) gjør det mulig for en forsker å umiddelbart snap-fryse de innsamlede prøvene i strekkodede kryovialer på tørris ved -80 °C i operasjonssalen (OR). Denne prosedyren sikrer en høy og konsistent prøvekvalitet for nedstrøms molekylær analyse. I tillegg til utmerket prøvekvalitet er nøyaktig annotering av prøver i en biobank kritisk. Ved hjelp av en nettbasert HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)-kompatibel REDCap (forskning elektronisk datafangst) database5, tillater vår arbeidsflyt lagring av detaljerte metadata for hver prøve, inkludert alder, kjønn, sykdom, sykdomsstadium, prøvetype, og unike egenskaper ved operasjonen. Dette vil muliggjøre nøyaktig fremtidig søkekapasitet, for eksempel for prøver fra en bestemt sykdom eller en bestemt gruppe pasienter. I tillegg arkiveres den nøyaktige plasseringen av hver prøve i fryseren ved hjelp av et kartesisk rutenettsystem, noe som muliggjør effektiv prøvehenting for nedstrøms eksperimenter. Vi viser eksempler på DNA-, protein-, glykan- og metabolittanalyser.
Vår arbeidsflyt representerer en praktisk og effektiv forbindelse mellom operasjonssalen og forskningslaboratoriet og gir et verdifullt grunnlag for translasjonsforskning.
Kirurgiske prøver fra pasienter tillater direkte molekylær karakterisering av sykdom hos levende mennesker 2,3,4,14, og kan bidra til å overvinne begrensningene i celle- og dyresykdomsmodeller som ikke fullt ut rekapitulerer menneskelig sykdom 15,16. Molekylær analyse av humant vev kan forbedre utvelgelsen av nye legemiddelmål og kan bidra til en høyere suksessrate for kliniske studier og legemiddelgodkjenning17. I tillegg gir denne tilnærmingen potensialet for personlig medisin, da det oppnådde vevet beholder det unike genomiske, epigenomiske, metabolomiske, glykomiske og proteomiske fingeravtrykket til hver enkeltperson 2,18,19.
Høy og konsistent prøvekvalitet er grunnleggende for alle molekylære analyseapplikasjoner. Tidligere studier har vist at umiddelbar frysing etter prøveuthenting og unngåelse av gjentatte fryse-/tinesykluser er kritisk for høy prøvekvalitet 9,20. Langtidslagring over flere år ved -70 °C påvirket ikke integriteten til den proteomiske profilen9 signifikant. En standardisert protokoll er et viktig grunnlag for å redusere skjevhet og forbedre sammenlignbarheten av vitenskapelige data, spesielt når flere personer (kirurger, teknikere og andre) eller forskjellige institusjoner er involvert i prøvetakingsprosessen. Bortsett fra prøvekvaliteten er annotering av prøver en annen viktig faktor som krever standardisering for å tillate korrelasjon av molekylære funn med kliniske data. Vår protokoll er avhengig av tre viktige prinsipper for å oppnå dette: 1) en standardisert prøvetakingsprosedyre for vandig humor og glassaktige flytende biopsier av en oftalmisk kirurg, 2) umiddelbar behandling og snap-frysing av prøver i OR av laboratoriepersonell, og 3) en metadatamerknad av hver prøve i en nettbasert database som gjør det mulig for forskere å raskt finne prøver for senere eksperimenter.
I tillegg til glasslegemeprøver20, etablerer denne arbeidsflyten også den standardiserte samlingen av vandige væskebiopsier for molekylær analyse. Den vandige humor er en svært tilgjengelig, kompleks væske i øyets fremre kammer som ikke bare reflekterer okulære sykdommer i det fremre, men også av det bakre segmentet av øyet, inkludert retinal sykdom18,21. Sammen med det faktum at et høyt antall vandige humorprøver kan samles inn, for eksempel under kataraktkirurgi, en av de hyppigst utførte operasjonene over hele verden, gjør disse funksjonene det til en interessant kilde for flytende biopsier fra det menneskelige øye. Den standardiserte metadataannotasjonen for hver prøve som er etablert i denne arbeidsflyten, kan også tillate korrelasjon av proteomdata med prospektive kliniske oppfølgingsdata. Dette gir spennende mulighet til å identifisere nye prognostiske biomarkører som kan bidra til å estimere prognosen for fremtidige pasienter.
Imidlertid har molekylær analyse av humane kirurgiske prøver også viktige begrensninger. For eksempel er komplekse eksperimentelle manipulasjoner ofte bare mulige i dyre- og cellemodeller. En løsning kan være å sammenligne den molekylære profilen til dyre- eller cellemodeller med den menneskelige sykdommen. Denne strategien kan identifisere overlappende proteinbiomarkører og terapeutiske mål som kan valideres i dyr eller cellemodeller for å identifisere de mest lovende kandidatene som korrelerer med menneskelig sykdom og sannsynligvis vil lykkes i kliniske studier 4,16.
Avslutningsvis etablerer arbeidsflyten vårt et praktisk grensesnitt mellom OR og forskningslaboratoriet som tillater standardisert innsamling, merknad og lagring av kirurgiske prøver av høy kvalitet for molekylær nedstrømsanalyse, noe som gir et verdifullt grunnlag for fremtidig translasjonsforskning.
The authors have nothing to disclose.
VBM støttes av NIH-tilskudd (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 og P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen, og Research to Prevent Blindness, New York, USA. JW og DR støttes av VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR er støttet av DARE Fellowship, som er sponset av Lundbeck Foundation.
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |