O presente protocolo descreve a reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (ADP) e de células epiteliais ductais pancreáticas normais em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Fornecemos um procedimento otimizado e detalhado, passo a passo, desde a preparação do lentivírus até o estabelecimento de linhas iPSC estáveis.
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Artigo de método
Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência
Neste artigo
Resumo
Resumo
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando fatores de transcrição tem sido obtida a partir de quase qualquer tipo celular diferenciado e tem se mostrado altamente valiosa para pesquisas e aplicações clínicas. Curiosamente, a reprogramação iPSC de células cancerosas, como o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), demonstrou reverter o fenótipo invasivo de ADP e anular o epigenoma do câncer. A diferenciação de iPSCs derivadas do PDAC pode recapitular a progressão do ADP a partir de seu precursor precoce da neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando as mudanças moleculares e celulares que ocorrem precocemente durante a progressão do ADP. Portanto, iPSCs derivadas do PDAC podem ser usadas para modelar os estágios iniciais do PDAC para a descoberta de marcadores diagnósticos de detecção precoce. Isso é particularmente importante para pacientes com ADP, que geralmente são diagnosticados nos estágios metastáticos tardios devido à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais da PanIN. No entanto, a reprogramação de linhagens de células cancerosas, incluindo PDAC, em pluripotência permanece desafiadora, trabalhosa e altamente variável entre diferentes linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo mais consistente para gerar iPSCs a partir de várias linhagens celulares PDAC humanas usando vetores lentivirais bicistrônicos. As linhagens iPSC resultantes são estáveis, não mostrando dependência da expressão exógena de fatores reprogramadores ou drogas induzíveis. Em geral, esse protocolo facilita a geração de uma ampla gama de iPSCs derivadas do PDAC, o que é essencial para a descoberta precoce de biomarcadores mais específicos e representativos dos casos de ADP.
Introdução
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma das neoplasias malignas mais fatais, e o diagnóstico precoce permanece desafiador devido à natureza assintomática da doença. A maioria dos pacientes com ADP é diagnosticada na fase metastática avançada, quando opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis 1,2. Isso se deve principalmente à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais, como aqueles que poderiam ser convenientemente detectados como proteínas liberadas na corrente sanguínea.
O ADP pode disseminar-se muito precocemente durante sua progressão, e um m....
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da OHSU. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Todos os trabalhos em animais para tumores PDX foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Uso e Cuidado Animal da OHSU (IACUC). Este protocolo foi testado em células PDAC primárias de xenoenxerto derivado do paciente (PDX), linhagem celular BxPc3 exibindo morfologia epitelial que foi isolada do tecido pancreático de uma paciente de 61 anos com adenocarcinoma, linhagem celular epitelial imortalizada H6C7 derivada de epitélio normal do ducto pancreático humano normal e fi....
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Resultados
Imagens representativas mostrando a morfologia de colônias iPSC derivadas de células PDAC, BXPc3, H6C7 e hFib são mostradas na Figura 1. As colônias PDAC-iPSC começaram a se formar no dia 25 de reprogramação. Colônias robustas de iPSC com morfologia ESC-like mais estabelecida foram identificadas no 40º dia de reprogramação (Figura 1). Da mesma forma, a formação de BxPc3-iPSCs começou no dia 23 e se tornou mais estabelecida no dia.......
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Discussão
Para facilitar o uso da reprogramação iPSC para estudar a progressão do câncer, um protocolo robusto foi estabelecido para reprogramação de células de câncer de pâncreas. A reprogramação de células cancerosas em pluripotência tem se mostrado muito desafiadora até o momento, pois poucos estudos conseguiram gerar iPSCs a partir de células cancerosas32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <.......
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
A.S e J.K gostariam de agradecer à Cancer Research UK e à OHSU pelo financiamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A A.S é apoiada por um prêmio de desenvolvimento de carreira da MRC (MR/N024028/1). A.A é financiado por uma bolsa de doutorado (Bolsa ref. 1078107040) da Cidade Rei Abdulaziz para Ciência e Tecnologia. J.K é financiado pelo MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos ao Prof. Keisuke Kaji por gentilmente fornecer o vetor de reprogramação pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manus....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- humano TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Extrato de Pituitária Bovina (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Toxina da Cólera de Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Colágeno, solução Tipo I de cauda de rato | Merck | C3867 | |
| Concluído Definido K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Placas de Poço Múltiplo | Merck | ||
| Filtros de seringa Corning | Merck | ||
| Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Corning | Merck | ||
| Dia Impex Virkon Desinfetante Virucida Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′ s Fosfato Tampolado Salino (PBS) | Merck | D8537 | |
| Soro Fetal de Bezerro (FCS) | Reagente de Transfecção HD Fugene | 10270-106 | |
| Fisher | Promega | E2312 | |
| Solução de gelatina, Tipo B, 2% em H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Mídia Essencial Mínima (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Proteína Recombinante EGF Humana | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| FGF-basic Humana (FGF-2/bFGF) (154 aa) Proteína Recombinante, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Linha de Células Epiteliais de Duto Pancreático Humano (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF alimentador de células | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Soro de Queratinócitos Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Substituição do soro Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μ Unidade de Filtro de Seringa M (Estéril) | Merck | ||
| Opti-MEM Medium de Soro Reduzido | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polibreno (brometo de hexadimetrina) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Médio (modificação ATCC) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Seringas Estéreis para Uso Único (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| Enzima TrypLE Express (1x), vermelho de fenol | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dicloridrato) | STEMCELL Technologies | 72304 |
Referências
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al.
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Reimpressões e permissões
