Эксплантация мембраны с круглым окном морской свинки для исследований ex vivo
Summary
В этом протоколе описывается метод эксплантации мембраны круглого окна из височных костей морских свинок, что является ценным ресурсом для исследований ex vivo .
Abstract
Эффективная и минимально инвазивная доставка лекарств во внутреннее ухо представляет собой серьезную проблему. Мембрана круглого окна (RWM), являющаяся одной из немногих точек входа во внутреннее ухо, стала жизненно важным объектом исследований. Однако из-за сложностей выделения RWM наше понимание его фармакокинетики остается ограниченным. RWM состоит из трех отдельных слоев: наружного эпителия, среднего слоя соединительной ткани и внутреннего эпителиального слоя, каждый из которых потенциально обладает уникальными свойствами доставки.
Современные модели для исследования переноса через RWM используют модели животных in vivo или модели ex vivo RWM, которые полагаются на клеточные культуры или фрагменты мембран. Морские свинки служат валидированной доклинической моделью для исследования фармакокинетики лекарств во внутреннем ухе и являются важной животной моделью для трансляционной разработки средств доставки в улитку. В этом исследовании мы описываем подход к эксплантации RWM морской свинки с окружающей кохлеарной костью для экспериментов по настольной доставке лекарств. Этот метод позволяет сохранить исходную архитектуру RWM и может обеспечить более реалистичное представление транспортных барьеров по сравнению с текущими настольными моделями.
Introduction
Появились новые классы терапевтических средств для лечения нейросенсорной тугоухости. Трансляция этих терапевтических препаратов в клинические популяции ограничена безопасными и эффективными путями транспортировки во внутреннее ухо. Современные методы доставки in vivo в исследованиях на животных основаны либо на фенестрации во внутреннем ухе, либо на диффузии через мембрану круглого окна (RWM), бескостный барьер, который отделяет пространство среднего уха от улитки1.
Хирургическая фенестрация и микроинъекция во внутреннее ухо являются инвазивными и могут представлять опасность для остаточной функции внутреннего уха2. Таким образом, RWM является важным маршрутом для местной доставки лекарств, а морские свинки являются основной доклинической моделью на животных, используемой для изучения фармакокинетики местных лекарств в RWM и во внутреннем ухе для фармацевтических разработок 3,4. Несмотря на то, что морская свинка тоньше RWM, она имеет идентичную трехслойную структуру. Он имеет диаметр около 1 мм, толщину 15-25 мкм и состоит из двух слоев эпителиальных клеток, скрепляющих слой соединительной ткани5. Эпителиальный слой, обращенный к среднему уху, плотно упакован и соединен плотными соединениями, в то время как слой, обращенный к внутреннему уху и scala tympani, имеет более рыхлую архитектуру и не имеет значительных межклеточных спаек.
Современные доклинические исследования, изучающие лекарственную проницаемость RWM морских свинок, основаны на инъекциях в среднее ухо in vivo с последующим забором проб перилимфатической жидкости во внутреннем ухе, что не позволяет провести специфическое исследование транспорта RWM 6,7. Фрагменты эксплантов RWM использовались в доклинических исследованиях, но из-за своей хрупкости и небольшого размера они не подходят для систематических микрофлюидных исследований транспортировки лекарств и транспортных средств, требующих водонепроницаемого уплотнения через RWM2. Другие группы использовали модели in vitro с культивируемыми эпителиальными клетками человека, чтобы приблизиться к RWM 8,9,10. Тем не менее, большинство этих конструкций сосредоточены исключительно на внешнем эпителиальном слое и не отражают сложность архитектуры нативной ткани. Для более детального понимания механизмов транспортировки в RWM необходимы целевые исследования ex vivo.
В данном исследовании мы демонстрируем эксплантацию RWM морской свинки с окружающей костной опорой для сохранения целостности мембраны и иллюстрируем их использование в экспериментальной парадигме, предназначенной для специфического изучения RWM-транспорта транспортных средств доставки лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
При локальной доставке лекарств в ухо RWM является основным путем прохождения терапевтических препаратов во внутреннее ухо. Для лучшего понимания механизмов транспортировки и проницаемости новых средств доставки и разработки лекарств необходима точная и надежная настольная модель. В…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами NIDCD No 1K08DC020780 и 5T32DC000027-33, а также Фондом исследований слуха им. Рубинштейна.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
Referências
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
