Vi præsenterer to sondebaserede interne et-trins RT-qPCR-sæt til almindelige luftvejsvira. Det første assay er for SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 og H3N2) og influenza B. Den anden er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analyser kan implementeres med succes i ethvert specialiseret laboratorium.
Det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der forårsager Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mod offentlighedens sundhed. I influenzasæsoner kan spredningen af SARS-CoV-2 og andre luftvejsvira forårsage en byrde af luftvejssygdomme i hele befolkningen, der er vanskelig at håndtere. Til det skal respiratoriske vira SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåges nøje i de kommende efterårs- og vintersæsoner, især i tilfælde af SARS-CoV-2, influenza A og influenza B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som modtagelige populationer, transmissionsmåde og kliniske syndromer. Uden målspecifikke analyser kan det være udfordrende at skelne mellem tilfælde af disse vira på grund af deres ligheder. Derfor vil et følsomt og målrettet multiplexassay, der let kan skelne mellem disse virale mål, være nyttigt for sundhedspersonale. I denne undersøgelse udviklede vi et realtids revers transkriptase-PCR-baseret assay ved hjælp af et internt udviklet R3T et-trins RT-qPCR-kit til samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier af deres syntetiske RNA’er kan vi med succes identificere SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og MERS-CoV-mål samtidigt med 100% specificitet. Denne analyse viser sig at være nøjagtig, pålidelig, enkel, følsom og specifik. Den udviklede metode kan bruges som et optimeret SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk assay på hospitaler, medicinske centre og diagnostiske laboratorier samt til forskningsformål.
Pandemien af den igangværende coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er forårsaget af den nye coronavirus kendt som det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund af SAR-CoV-2’s stærke smitsomhed og kapacitet til hurtig transmission opstod COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte sig hurtigt over hele verden. Dette førte til sidst til starten af tegn på åndedrætsbesvær og endda død 2,3,4. COVID-19 er blevet erklæret en pandemi i mere end 213 lande og forventer en kraftig stigning i antallet af bekræftede tilfælde, som det fremgår af papirerne offentliggjort af forskellige forskningsundersøgelser 3,5. COVID-19 overføres primært af små åndedrætsdråber, som inficerede personer frigiver i miljøet og derefter udsættes for sårbare personer gennem indånding eller tæt kontakt med forurenede overflader. Når disse dråber kommer i kontakt med slimhinden i øjne, mund eller næse, kan en person blive smittet6. Statistikker frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) viser, at der har været mere end 76 millioner bekræftede tilfælde af pandemien på verdensplan med svimlende 7 millioner dødsfald7. FN klassificerede således pandemien forårsaget af COVID-19-sygdommen som en katastrofe på grund af dens direkte indvirkning på milliarder af menneskers liv over hele kloden og havde vidtrækkende økonomiske, miljømæssige og sociale virkninger.
Folkesundhedsinitiativer, herunder grundig testning, tidlig påvisning, kontaktsporing og isolering af tilfælde, har alle vist sig at være afgørende for at holde denne pandemi under kontrol 8,9,10,11. Vintermånederne vil øge cirkulationen af andre luftvejsvira som influenza A og B med COVID-19-lignende symptomer, hvilket gør det vanskeligt at identificere, spore og isolere COVID-19-tilfælde tidligt. Hvert år starter influenza A- og B-udbrud i det sene efterår eller begyndelsen af januar med en forudsigelig sæsonudsving12. Talrige epidemiologiske træk deles af SARS-CoV-2- og influenzavirus. Desuden deler ligheder i de modtagelige populationer, der inkluderer børn, ældre, immunkompromitterede og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, hjerte- og nyresvigt eller diabetes12,13. Disse vira deler ikke kun sårbare populationer, men også transmissionsveje for kontakt og åndedrætsdråber14. Det forventes, at patienter sandsynligvis kan indgå mere end en af disse respiratoriske vira, når influenzasæsonen nærmer sig14. Til det skal screeningen af SARS-CoV-2 og influenzavirus udføres på symptomatiske patienter, før de isoleres. Det er ikke muligt at køre separate tests for de tre vira (SARS-CoV-2, influenza A og influenza B) på grund af den globale mangel på ressourcer til nukleinsyreekstraktion og diagnostik. For at screene dem alle i en reaktion skal der udvikles en metode eller test.
Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS)-CoV er et familiemedlem til human coronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolater kom fra en indlagt patient i Saudi-Arabien, der var død i september 2012 på grund af akutte åndedrætsproblemer15. Der er beviser, der tyder på, at en fremtrædende reservoirvært for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist, at vira fra inficerede dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan inficere mennesker16,17. Mennesker inficeret med denne virus kan sprede den til andre gennem tæt kontakt18. Pr. 26. januar 2018 havde der været 2143 laboratoriebekræftede tilfælde af MERS-CoV-infektion, herunder 750 dødsfald globalt19. De mest typiske MERS-CoV symptomer er hoste, feber og åndenød. MERS-CoV-infektioner er også blevet rapporteret at udvise lungebetændelse, diarré og gastrointestinale sygdomssymptomer20. I øjeblikket er der ingen kommerciel vaccine eller specifik behandling for MERS-CoV tilgængelig. Derfor er hurtig og præcis diagnose afgørende for at forhindre de udbredte MERS-CoV-udbrud og differentiere MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sygdommen.
Til dato er der foreslået mange tilgange til at detektere disse vira, såsom multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserede biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-test i en gryde 32, DNA-aptamer33, loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP)19,34 osv. Hver af de ovennævnte metoder har unikke fordele og ulemper med hensyn til følsomhed og specificitet. Blandt disse metoder er den nukleinsyreamplifikationsbaserede test: multiplex qRT-PCR, den mest almindelige og anses for at være guldstandarden til diagnosticering af SARS-CoV-2, influenza A, influenza B og MERS-CoV.
I denne undersøgelse designede og vurderede vi forskellige primerkombinationer og sonder til effektiv, nøjagtig og samtidig påvisning af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved hjælp af standard twist syntetiske virale RNA’er. De multipleksede assays udviklet til enten MERS-CoV eller SARS-CoV-2 målgener anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO). Disse gener koder generelt for proteiner og komplekser, der bidrager til dannelsen af et replikations-/transkriptionskompleks (RTC)35, såsom regionen inden for den åbne læseramme 1a (ORF1a), der anvendes til MERS-CoV-assay. Derudover kodes strukturelle proteiner af de gener, der anvendes i diagnostiske assays, såsom opstrømsregionen af kuvertgenet (upE) og nukleocapsidgenet (N), der anvendes til henholdsvis MERS-CoV- og SARS-Cov-2-assays, 35,36. Vi brugte internt R3T et-trins RT-qPCR-sæt til at etablere RT-qPCR til påvisning af vira37. Virusdetektion, følsomhed, specificitet og dynamisk område af vores R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primersæt blev testet og evalueret ved hjælp af 10 gange serielle fortyndinger af standard twist syntetiske RNA’er. Den laveste praktiske detektionsgrænse var ca. 10 udskriftskopier pr. Reaktion. Som et resultat kan det interne R3T et-trins RT-qPCR-sæt og primer-/sondesæt med succes anvendes og implementeres til rutinemæssig samtidig diagnose af SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.
Der er en tung økonomisk byrde for sundhedssystemet over hele verden som følge af de høje infektions- og dødelighedsrater på grund af spredningen af almindelige luftvejsvira såsom SARS-CoV-2, influenza A / B og MERS-CoV-varianter 12,19,20. Motiveret af ansvarsfølelsen mod at lette denne byrde indså vi behovet for en hurtig, præcis og tilgængelig diagnostisk analyse såsom RT-qPCR for at skelne mellem disse almindelige …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af King Abdullah University of Science and Technology gennem kernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH.
0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
Protein marker | Fermentas | 26616 | |
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
X-Gal | Invitrogen | B1690 |