JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Abstract

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, vormt een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in het algemeen. Tijdens griepseizoenen kan de verspreiding van SARS-CoV-2 en andere respiratoire virussen een bevolkingsbrede last van luchtwegaandoeningen veroorzaken die moeilijk te beheersen is. Daarvoor zullen de respiratoire virussen SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) in de komende herfst- en winterseizoenen zorgvuldig in de gaten moeten worden gehouden, met name in het geval van SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B, die vergelijkbare epidemiologische factoren delen, zoals vatbare populaties, wijze van overdracht en klinische syndromen. Zonder doelwitspecifieke tests kan het een uitdaging zijn om onderscheid te maken tussen gevallen van deze virussen vanwege hun overeenkomsten. Dienovereenkomstig zal een gevoelige en gerichte multiplextest die gemakkelijk onderscheid kan maken tussen deze virale doelwitten nuttig zijn voor beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg. In deze studie ontwikkelden we een real-time reverse transcriptase-PCR-gebaseerde assay met behulp van een in-house ontwikkelde R3T eenstaps RT-qPCR-kit voor gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV. Met slechts 10 kopieën van hun synthetische RNA’s kunnen we met succes SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en MERS-CoV-doelen tegelijkertijd identificeren met 100% specificiteit. Deze test blijkt nauwkeurig, betrouwbaar, eenvoudig, gevoelig en specifiek te zijn. De ontwikkelde methode kan worden gebruikt als een geoptimaliseerde SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostische test in ziekenhuizen, medische centra en diagnostische laboratoria, evenals voor onderzoeksdoeleinden.

Introduction

De pandemie van de aanhoudende coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het nieuwe coronavirus dat bekend staat als het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Vanwege de sterke besmettelijkheid van SAR-CoV-2 en het vermogen tot snelle overdracht, ontstond de COVID-19-pandemie in Wuhan City, China, en verspreidde zich snel over de hele wereld. Dit leidde uiteindelijk tot het begin van tekenen van ademnood en zelfs de dood 2,3,4. COVID-19 is in meer dan 213 landen uitgeroepen tot pandemie, waarbij een sterke toename van het aantal bevestigde gevallen wordt verwacht, zoals blijkt uit de artikelen die door verschillende onderzoeken zijn gepubliceerd 3,5. COVID-19 wordt voornamelijk overgedragen door kleine ademhalingsdruppeltjes die geïnfecteerde personen in het milieu afgeven en vervolgens worden blootgesteld aan kwetsbare personen door inademing of nauw contact met besmette oppervlakken. Wanneer deze druppeltjes in contact komen met het slijmvlies van de ogen, mond of neus, kan een persoon besmet raken6. Uit statistieken van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijkt dat er wereldwijd meer dan 76 miljoen bevestigde gevallen van de pandemie zijn geweest, met maar liefst 7 miljoen doden7. Zo classificeerden de Verenigde Naties de pandemie veroorzaakt door de ziekte COVID-19 als een ramp vanwege de directe impact op het leven van miljarden mensen over de hele wereld en had verstrekkende economische, ecologische en sociale gevolgen.

Initiatieven op het gebied van de volksgezondheid, waaronder grondige tests, vroege opsporing, contactopsporing en isolatie van gevallen, blijken allemaal cruciaal te zijn om deze pandemie onder controle te houden 8,9,10,11. De wintermaanden zullen de circulatie van andere respiratoire virussen zoals Influenza A en B met COVID-19-achtige symptomen verhogen, waardoor het moeilijk wordt om COVID-19-gevallen in een vroeg stadium te identificeren, op te sporen en te isoleren. Elk jaar begint de uitbraak van influenza A en B in de late herfst of begin januari met een voorspelbare seizoensgebondenheid12. Talrijke epidemiologische kenmerken worden gedeeld door SARS-CoV-2- en influenzavirussen. Bovendien delen ze overeenkomsten in de vatbare populaties, waaronder kinderen, ouderen, immuungecompromitteerden en personen met chronische comorbiditeiten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, hart- en nierfalen of diabetes12,13. Deze virussen delen niet alleen kwetsbare populaties, maar ook transmissieroutes van contact en ademhalingsdruppeltjes14. Verwacht wordt dat patiënten waarschijnlijk meer dan één van deze respiratoire virussen kunnen oplopen naarmate het griepseizoennadert 14. Daarvoor moet de screening van SARS-CoV-2 en de influenzavirussen worden uitgevoerd op symptomatische patiënten voordat ze worden geïsoleerd. Het uitvoeren van afzonderlijke tests voor de drie virussen (SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B) is niet mogelijk vanwege het wereldwijde gebrek aan middelen voor nucleïnezuurextractie en diagnostiek. Om ze allemaal in één reactie te screenen, moet een methode of test worden ontwikkeld.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is een familielid van het menselijke coronavirus (CoV). De eerste isolaten van het MERS-CoV-virus waren afkomstig van een gehospitaliseerde patiënt in Saoedi-Arabië die in september 2012 was overleden als gevolg van acute ademhalingsproblemen. Er zijn aanwijzingen dat dromedariskamelen een prominente reservoirgastheer voor MERS-CoV zijn. Het is bewezen dat virussen van geïnfecteerde dromedariskamelen zoönotisch zijn en dus mensen kunnen infecteren16,17. Mensen die met dit virus zijn besmet, kunnen het via nauw contact naar anderen verspreiden18. Op 26 januari 2018 waren er 2143 laboratoriumbevestigde gevallen van MERS-CoV-infectie, waaronder 750 sterfgevallen wereldwijd. De meest typische MERS-CoV-symptomen zijn hoesten, koorts en kortademigheid. Er is ook gemeld dat MERS-CoV-infecties symptomen van longontsteking, diarree en gastro-intestinale misselijkheid vertonen20. Momenteel is er geen commercieel vaccin of specifieke behandeling voor MERS-CoV beschikbaar. Daarom is een snelle en nauwkeurige diagnose essentieel om de wijdverbreide MERS-CoV-uitbraken te voorkomen en MERS-CoV te onderscheiden van de ziekte SARS-CoV-2.

Tot op heden zijn er veel benaderingen voorgesteld om deze virussen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 en CRISPR/Cas329, laterale flow-immunoassay30, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren31, SHERLOCK-testen in één pot32, DNA-aptameer 33, lusgemedieerde isotherme versterking (LAMP)19,34, enz. Elk van de bovengenoemde methoden heeft unieke voor- en nadelen op het gebied van gevoeligheid en specificiteit. Van deze methoden is de op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde test: multiplex qRT-PCR, de meest voorkomende en wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en MERS-CoV.

In deze studie hebben we verschillende primercombinaties en sondes ontworpen en beoordeeld voor de effectieve, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV met behulp van standaard twist synthetische virale RNA’s. De gemultiplexte tests die zijn ontwikkeld voor MERS-CoV- of SARS-CoV-2-doelgenen worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze genen coderen over het algemeen voor eiwitten en complexen die bijdragen aan de vorming van een replicatie/transcriptiecomplex (RTC)35, zoals het gebied binnen het open leesframe 1a (ORF1a) dat wordt gebruikt voor de MERS-CoV-test. Bovendien worden structurele eiwitten gecodeerd door de genen die worden gebruikt in diagnostische tests, zoals het stroomopwaartse gebied van het envelopgen (upE) en het nucleocapside-gen (N) die worden gebruikt voor respectievelijk MERS-CoV- en SARS-Cov-2-assays35,36. We gebruikten de interne R3T eenstaps RT-qPCR-kit om de RT-qPCR voor de detectie van virussen vast te stellen37. Virusdetectie, gevoeligheid, specificiteit en dynamisch bereik van onze R3T one-step RT-qPCR kit en primersets werden getest en geëvalueerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard twist synthetische RNA’s. De laagste praktische detectielimiet was ongeveer 10 transcriptiekopieën per reactie. Als gevolg hiervan kunnen de interne R3T-eenstaps RT-qPCR-kit en primer-/sondesets met succes worden gebruikt en geïmplementeerd voor routinematige gelijktijdige diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Taq-polymerase-expressie en -zuivering Construeer een plasmide met een splitsbare hexa-histidine-tag aan de C-terminus van het enzym. Transformeer 50 ng van de expressievector in E. coli BL21-(DE3)-stam volgens het standaardprotocol38. Inoculeer de getransformeerde cellen in vier kolven van 6 l met elk 2 l 2YT-mediabouillon bij 37 °C en schud bij 170 omw/min totdat de OD 600 van 0,8 of celnummer 6,4 x10,8 is bereikt. …

Representative Results

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de diagnostische benadering voor het detecteren van veel voorkomende respiratoire virussen met behulp van PCR-benaderingen 21,22,23,24,25. Ondanks deze vooruitgang is de multiplex-benadering, die het mogelijk maakt om meerdere virussen in één test te detecteren, echter niet op grote schaal geïm…

Discussion

Er is wereldwijd een zware economische last voor het gezondheidszorgsysteem als gevolg van de hoge infectie- en sterftecijfers als gevolg van de verspreiding van veel voorkomende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV-varianten 12,19,20. Gemotiveerd door het verantwoordelijkheidsgevoel om deze last te verlichten, realiseerden we ons de noodzaak van een snelle, nauwkeurige en toegankelijke diagnostische…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology door middel van kernfinanciering en de National Term Grand Challenge (NTGC) aan SMH.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

SARS-CoV-2Influenza AInfluenza BMERS-CoVMultiplex Real-time RT-qPCRRespiratory VirusesIn-house Developed R3T One-step RT-qPCR KitDiagnostic AssaySimultaneous DetectionSensitivitySpecificity
check_url/pt/65822?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image