Vi presenterer to sondebaserte interne ett-trinns RT-qPCR-sett for vanlige luftveisvirus. Den første analysen er for SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 og H3N2) og influensa B. Den andre er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analysene kan med hell implementeres i ethvert spesialisert laboratorium.
Det alvorlige akutte luftveissyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som forårsaker Coronavirus sykdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mot allmennhetens helse. Under influensasesonger kan spredning av SARS-CoV-2 og andre respiratoriske virus forårsake en populasjonsomfattende byrde av luftveissykdom som er vanskelig å håndtere. For det må respiratoriske virus SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåkes nøye i de kommende høst- og vintersesongene, spesielt når det gjelder SARS-CoV-2, influensa A og influensa B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som følsomme populasjoner, overføringsmåte og kliniske syndromer. Uten målspesifikke analyser kan det være utfordrende å skille mellom tilfeller av disse virusene på grunn av deres likheter. Følgelig vil en sensitiv og målrettet multipleksanalyse som lett kan skille mellom disse virale målene, være nyttig for helsepersonell. I denne studien utviklet vi en sanntids revers transkriptase-PCR-basert analyse ved hjelp av et internt utviklet R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier av deres syntetiske RNA kan vi med hell identifisere SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV-mål samtidig med 100% spesifisitet. Denne analysen er funnet å være nøyaktig, pålitelig, enkel, sensitiv og spesifikk. Den utviklede metoden kan brukes som en optimalisert SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analyse på sykehus, medisinske sentre og diagnostiske laboratorier, samt til forskningsformål.
Pandemien av den pågående koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) er forårsaket av det nye koronaviruset kjent som alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grunn av SAR-CoV-2s sterke smittsomhet og kapasitet for rask overføring, oppsto COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte seg raskt over hele verden. Dette førte til slutt til starten av respiratoriske nødtegn og til og med død 2,3,4. COVID-19 har blitt erklært en pandemi i mer enn 213 land, og forventer en bratt økning i antall bekreftede tilfeller, som det fremgår av papirene publisert av forskjellige forskningsstudier 3,5. COVID-19 overføres primært av små luftveisdråper som infiserte individer slipper ut i miljøet og deretter blir utsatt for sårbare individer gjennom innånding eller nær kontakt med forurensede overflater. Når disse dråpene kommer i kontakt med slimhinnen i øynene, munnen eller nesen, kan en person bli smittet6. Statistikk utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) viser at det har vært mer enn 76 millioner bekreftede tilfeller av pandemien over hele verden, med svimlende 7 millioner dødsfall7. Dermed klassifiserte FN pandemien forårsaket av COVID-19-sykdommen som en katastrofe på grunn av dens direkte innvirkning på livene til milliarder av mennesker over hele verden og hadde vidtrekkende økonomiske, miljømessige og sosiale effekter.
Folkehelseinitiativer, inkludert grundig testing, tidlig oppdagelse, kontaktsporing og isolering av tilfeller, har alle vist seg å være avgjørende for å holde denne pandemien under kontroll 8,9,10,11. Vintermånedene vil øke sirkulasjonen av andre luftveisvirus som influensa A og B med COVID-19-lignende symptomer, noe som gjør det vanskelig å identifisere, spore opp og isolere COVID-19-tilfeller tidlig. Hvert år starter influensa A- og B-utbruddet sent på høsten eller begynnelsen av januar med en forutsigbar sesongmessighet12. Tallrike epidemiologiske trekk deles av SARS-CoV-2 og influensavirus. Dessuten deler likheter i de mottakelige populasjonene som inkluderer barn, eldre, immunkompromitterte og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, hjerte- og nyresvikt eller diabetes12,13. Disse virusene deler ikke bare sårbare befolkninger, men også overføringsruter for kontakt og luftveisdråper14. Det forventes at pasienter sannsynligvis kan få mer enn ett av disse respiratoriske virusene når influensasesongen nærmer seg14. For det må screeningen av SARS-CoV-2 og influensavirusene gjøres på symptomatiske pasienter før de isoleres. Å kjøre separate tester for de tre virusene (SARS-CoV-2, influensa A og influensa B) er ikke mulig på grunn av den globale mangelen på ressurser for nukleinsyreekstraksjon og diagnostikk. For å skjerme dem alle i en reaksjon, må en metode eller test utvikles.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV er et familiemedlem av humant koronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolatene kom fra en innlagt pasient i Saudi-Arabia som døde i september 2012 på grunn av akutte luftveisproblemer15. Det er bevis som tyder på at en fremtredende reservoarvert for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist at virus fra infiserte dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan infisere mennesker16,17. Mennesker smittet med dette viruset kan spre det til andre gjennom nær kontakt18. Per 26. januar 2018 hadde det vært 2143 laboratoriebekreftede tilfeller av MERS-CoV-infeksjon, inkludert 750 dødsfall globalt19. De mest typiske MERS-CoV-symptomene er hoste, feber og kortpustethet. MERS-CoV-infeksjoner har også blitt rapportert å vise lungebetennelse, diaré og gastrointestinale sykdomssymptomer20. For tiden er ingen kommersiell vaksine eller spesifikk behandling for MERS-CoV tilgjengelig. Derfor er rask og presis diagnose avgjørende for å forhindre de utbredte MERS-CoV-utbruddene og skille MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sykdom.
Til dags dato har mange tilnærminger blitt foreslått for å oppdage disse virusene som multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserte biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-testing i en pott 32, DNA-aptamer33, loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP)19,34 osv. Hver av de nevnte metodene har unike fordeler og ulemper når det gjelder følsomhet og spesifisitet. Blant disse metodene er nukleinsyreforsterkningsbasert test: multiplex qRT-PCR, den vanligste og anses å være gullstandarden for diagnostisering av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV.
I denne studien designet og vurderte vi ulike primerkombinasjoner og prober for effektiv, nøyaktig og samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved bruk av standard vri syntetiske virale RNAer. De multipleksede analysene utviklet for enten MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO). Disse genene koder generelt for proteiner og komplekser som bidrar til dannelsen av et replikasjons-/transkripsjonskompleks (RTC)35, slik som regionen innenfor den åpne leserammen 1a (ORF1a) som brukes til MERS-CoV-analyse. I tillegg er strukturelle proteiner kodet av gener som brukes i diagnostiske analyser som oppstrøms region av konvoluttgen (upE) og nukleokapsidgen (N) som brukes til MERS-CoV og SARS-Cov-2 analyser, henholdsvis35,36. Vi brukte internt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for å etablere RT-qPCR for påvisning av virus37. Virusdeteksjon, følsomhet, spesifisitet og dynamisk område for vårt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett og primersett ble testet og evaluert ved hjelp av 10 ganger serielle fortynninger av standard vri syntetiske RNA-er. Den laveste praktiske deteksjonsgrensen var ca. 10 transkripsjonskopier per reaksjon. Som et resultat kan det interne R3T ett-trinns RT-qPCR-settet og primer-/sondesettene med hell brukes og implementeres for rutinemessig samtidig diagnose av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.
Det er en stor økonomisk byrde på helsevesenet over hele verden som følge av de høye infeksjons- og dødelighetsratene på grunn av spredningen av vanlige luftveisvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV-variantene 12,19,20. Motivert av ansvarsfølelsen for å lette denne byrden, innså vi behovet for en rask, presis og tilgjengelig diagnostisk analyse som RT-qPCR for å skille mellom disse vanlige virusene i en test….
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH
0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
Protein marker | Fermentas | 26616 | |
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
X-Gal | Invitrogen | B1690 |