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Biologia

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
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1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Abstract

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que causa a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é uma séria ameaça à saúde pública em geral. Durante as temporadas de gripe, a disseminação do SARS-CoV-2 e de outros vírus respiratórios pode causar uma carga populacional de doença respiratória difícil de controlar. Para isso, os vírus respiratórios SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) precisarão ser cuidadosamente observados nas próximas temporadas de outono e inverno, particularmente no caso do SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, que compartilham fatores epidemiológicos semelhantes, como populações suscetíveis, modo de transmissão e síndromes clínicas. Sem ensaios alvo-específicos, pode ser difícil diferenciar entre os casos desses vírus devido às suas semelhanças. Assim, um ensaio multiplex sensível e direcionado que possa facilmente diferenciar entre esses alvos virais será útil para os profissionais de saúde. Neste estudo, nós desenvolvemos um ensaio baseado em transcriptase reversa em tempo real utilizando um kit RT-qPCR de uma etapa R3T desenvolvido internamente para detecção simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Com apenas 10 cópias de seus RNAs sintéticos, podemos identificar com sucesso alvos SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV simultaneamente com 100% de especificidade. Este ensaio é encontrado para ser preciso, confiável, simples, sensível e específico. O método desenvolvido pode ser usado como um ensaio de diagnóstico SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2 otimizado em hospitais, centros médicos e laboratórios de diagnóstico, bem como para fins de pesquisa.

Introduction

A pandemia da doença 2019 do coronavirus em curso (COVID-19) é causada pelo novo coronavirus conhecido como coronavirus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)1. Devido à forte contagiosidade do SAR-CoV-2 e à capacidade de transmissão rápida, a pandemia de COVID-19 surgiu na cidade de Wuhan, na China, e se espalhou rapidamente pelo mundo. Isso acabou levando ao aparecimento de sinais de desconforto respiratório e até mesmo à morte 2,3,4. A COVID-19 foi declarada pandemia em mais de 213 países, esperando-se um aumento acentuado no número de casos confirmados, como evidenciado pelos trabalhos publicados por diferentes estudos de pesquisa 3,5. A COVID-19 é transmitida principalmente por pequenas gotículas respiratórias que os indivíduos infectados liberam no ambiente e depois são expostos a indivíduos vulneráveis por inalação ou contato próximo com superfícies contaminadas. Quando essas gotículas entram em contato com a mucosa dos olhos, boca ou nariz, a pessoa pode se infectar6. Estatísticas divulgadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que houve mais de 76 milhões de casos confirmados da pandemia no mundo, com impressionantes 7 milhões demortes7. Assim, as Nações Unidas classificaram a pandemia causada pela doença COVID-19 como um desastre por causa de seu impacto direto na vida de bilhões de pessoas em todo o mundo e teve efeitos econômicos, ambientais e sociais de longo alcance.

Iniciativas de saúde pública, incluindo testes completos, detecção precoce, rastreamento de contatos e isolamento de casos, têm se mostrado cruciais para manter a pandemia sob controle 8,9,10,11. Os meses de inverno aumentarão a circulação de outros vírus respiratórios como Influenza A e B com sintomas semelhantes aos da COVID-19, dificultando a identificação, rastreamento e isolamento de casos de COVID-19 no início. Todos os anos, o surto de Influenza A e B inicia-se no final do outono ou início de janeiro, com uma sazonalidade previsível12. Numerosas características epidemiológicas são compartilhadas pelos vírus SARS-CoV-2 e Influenza. Além disso, compartilham semelhanças nas populações suscetíveis que incluem crianças, idosos, imunocomprometidos e indivíduos com comorbidades crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, insuficiência cardíaca e renal ou diabetes 12,13. Esses vírus não apenas compartilham populações vulneráveis, mas também vias de transmissão de contato e gotículas respiratórias14. Prevê-se que os pacientes possam provavelmente contrair mais de um desses vírus respiratórios à medida que a temporada de gripe se aproxima14. Para isso, o rastreamento do SARS-CoV-2 e dos vírus Influenza precisa ser feito em pacientes sintomáticos antes de serem isolados. A realização de testes separados para os três vírus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) não é possível devido à falta global de recursos para extração e diagnóstico de ácidos nucleicos. A fim de triá-los todos em uma reação, um método ou teste precisa ser desenvolvido.

A síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV é um membro da família do coronavírus humano (CoV). Os primeiros isolados do vírus MERS-CoV vieram de um paciente hospitalizado na Arábia Saudita que morreu em setembro de 2012 devido a problemas respiratórios agudos15. Há evidências que sugerem que um hospedeiro reservatório proeminente para o MERS-CoV são os camelos dromedários. Está comprovado que vírus de camelos dromedários infectados são zoonóticos e, portanto, podem infectar humanos16,17. Humanos infectados com esse vírus podem transmiti-lo a outras pessoas por meio de contato próximo18. Até 26 de janeiro de 2018, havia 2143 casos confirmados laboratorialmente de infecção por MERS-CoV, incluindo 750 mortes em todo o mundo19. Os sintomas mais típicos do MERS-CoV são tosse, febre e falta de ar. Também foram relatados que infecções por MERS-CoV apresentam sintomas de pneumonia, diarreia e doença gastrointestinal20. Atualmente, nenhuma vacina comercial ou tratamento específico para MERS-CoV está disponível. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso é essencial para prevenir os surtos generalizados de MERS-CoV e diferenciar o MERS-CoV da doença SARS-CoV-2.

Até o momento, muitas abordagens têm sido propostas para detectar esses vírus, tais como RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, imunoensaio de fluxo lateral30, sensores biomoleculares baseados em papel31, teste de SHERLOCK em um pote32, DNA aptamer33, isotérmico mediado por loop amplificação (LAMP)19,34, etc. Cada um dos métodos acima mencionados tem benefícios e desvantagens únicas em termos de sensibilidade e especificidade. Entre esses métodos, o teste baseado em amplificação de ácido nucleico: multiplex qRT-PCR, é o mais comum e é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.

Neste estudo, nós projectamos e avaliamos várias combinações do primer e sondas para a detecção eficaz, exacta, e simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando RNAs virais sintéticos da torção padrão. Os ensaios multiplexados desenvolvidos para os genes-alvo do MERS-CoV ou do SARS-CoV-2 são recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Esses genes geralmente codificam proteínas e complexos que contribuem para a formação de um complexo de replicação/transcrição (RTC)35, como a região dentro do open reading frame 1a (ORF1a) que é usada para o ensaio MERS-CoV. Além disso, as proteínas estruturais são codificadas pelos genes utilizados em ensaios diagnósticos, tais como a região a montante do gene do envelope (upE) e o gene do nucleocapsídeo (N), que são usados para ensaios MERS-CoV e SARS-Cov-2, respectivamente 35,36. Usamos o kit interno de RT-qPCR de uma etapa R3T para estabelecer o RT-qPCR para a detecção de vírus37. A detecção do vírus, a sensibilidade, a especificidade e a faixa dinâmica do nosso kit RT-qPCR de uma etapa R3T e dos conjuntos de primers foram testados e avaliados usando diluições seriadas de 10 vezes dos RNAs sintéticos de torção padrão. O menor limite prático de detecção foi de aproximadamente 10 cópias transcritas por reação. Como resultado, o kit RT-qPCR de uma etapa R3T interno e conjuntos de primer/sonda podem ser usados e implementados com sucesso para diagnóstico simultâneo de rotina de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Expressão e purificação da Taq polimerase Construir um plasmídeo com uma etiqueta hexa-histidina clivável no término C da enzima. Transformar 50 ng do vetor de expressão em cepa de E. coli BL21-(DE3) seguindo o protocolo padrão38. Inocular as células transformadas em quatro frascos de 6 L cada um contendo 2 L de caldo de meio 2YT a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir o OD 600 de 0,8 ou o número de célula 6,4 x 108<…

Representative Results

Nos últimos anos, houve avanços significativos na abordagem diagnóstica para detecção de vírus respiratórios comuns por meio de PCR21,22,23,24,25. No entanto, apesar desses avanços, a abordagem multiplexada, que permite detectar vários vírus em um único teste, não foi amplamente implementada, particularmente na plataforma RT-qPCR. Este método foi …

Discussion

Há uma pesada carga econômica sobre o sistema de saúde em todo o mundo resultante das altas taxas de infecção e mortalidade devido à disseminação de vírus respiratórios comuns, como as variantes SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivados pelo senso de responsabilidade em aliviar essa carga, percebemos a necessidade de um ensaio diagnóstico rápido, preciso e acessível, como o RT-qPCR, para distinguir en…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah através do financiamento principal e do National Term Grand Challenge (NTGC) para S.M.H.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
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Referências

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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
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