Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Abstract

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.

Introduction

A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns¹ e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a u....

Protocol

1. Protocolo para ensaio bang-sensitive

1. Estabelecer as moscas experimentais cruzando a linha condutora tub-Gal4 com a linha UAS-cac-RNAi através do sistema Gal4/UAS²¹. Coletar as moscas virgens da linhagem tub-Gal4 e as moscas machos da linhagem UAS-cac-RNAi . Em seguida, transfira as moscas virgens e machos para o mesmo frasco para colher a prole.
   NOTA: A linha de driver tub-Gal4 permitirá alcançar o knockdown global do gene cac . Use a linha UAS-cac-RNAi como grupo controle.
2. Após 3-5 dias de eclosão, anestesiar suavemente as moscas usando o ....

Results

Usando este protocolo, descobrimos que as moscas knockdown cac mostraram taxas significativamente mais altas de comportamento semelhante a convulsões do que as moscas WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] vs 4,50 ± 2,03 [n = 6]; P = 0,0061; Teste t de Student, Figura 1A). A maioria das moscas tub-Gal4>UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 1-5 s, enquanto UAS-cac-RNAi se recuperou dentro de 2 s. A porcentagem de recuperação de moscas knockdown de .......

Discussion

O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escovas	Panera	AAhc022-2	para manuseio de moscas
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Microscópio confocal	SP8; Zeiss, Jena, Alemanha.	N/A	para imagem de cálcio
CO2 máquina de anestesia	N/A	N/A	para anestesiar as moscas.
Suporte C-sharp	N/A	N/A	feito à mão, para montagem do cérebro
Frascos de cultura	Biologix	51-0500	2,5 cm de diâmetro, 9,5 cm de altura
Software Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA	versão: 2.14.0	para análise
Necrotério de moscas	N/A	N/A	feito à mão, para manuseio de moscas
Estoques de moscas	cac-RNAi	27244	de Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	de Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	do Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Câmera de alta	resolução N/A	N/A	para registrar o comportamento semelhante a uma convulsão ensaio
L-lisina	Sigma-Aldrich	L5626
Solução de cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Suspensão de papaína	Worthington Biochemical	LS003126
placas de Petri	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	para dissecção
Pipeta	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	para transportar um volume medido de líquido e cérebro profanado
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Prato de gravação	Thermo Scientific	150682- Prato à base de vidro	para segurar o cérebro e imagens de cálcio
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Cloreto de sódio ( NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Microscópio estereobinocular	SHANG GUANG	XTZ-D	para manuseio de moscas e dissecção
Agulhas de seringa	pythonbio	HCL0693	para dissecação
Tripé	WEIFENG	45634732523	para registrar o ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão
Misturador de vórtice	Dançarino de laboratório, IKA, Alemanha / Sigma-Aldrich	Z653438	para realizar o ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão
Quadro branco	N / A	N / A	feito à mão, almofada de espuma ou papel para fundo