Ex Vivo Kalciumavbildning för Drosophila-modell av epilepsi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. Protokollet ger ett värdefullt verktyg för att undersöka iktala händelser hos vuxna Drosophila genom ex vivo kalciumavbildning, vilket möjliggör utforskning av de potentiella mekanismerna för epilepsi på cellnivå.
Abstract
Epilepsi är en neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande anfall, delvis korrelerade med genetiskt ursprung, som drabbar över 70 miljoner individer världen över. Trots den kliniska betydelsen av epilepsi har den funktionella analysen av neural aktivitet i centrala nervsystemet ännu inte utvecklats. De senaste framstegen inom bildteknik, i kombination med stabilt uttryck av genetiskt kodade kalciumindikatorer, såsom GCaMP6, har revolutionerat studiet av epilepsi på både hjärn- och encellsupplösningsnivåer. Drosophila melanogaster har dykt upp som ett verktyg för att undersöka de molekylära och cellulära mekanismerna bakom epilepsi på grund av dess sofistikerade molekylära genetik och beteendeanalyser. I denna studie presenterar vi ett nytt och effektivt protokoll för ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. Hela hjärnan prepareras av cac, en välkänd epilepsigen, knockdownflugor för kalciumavbildning med ett konfokalmikroskop för att identifiera den neurala aktiviteten som en uppföljning till den smällkänsliga anfallsliknande beteendeanalysen. CAC knockdown-flugorna visade en högre frekvens av anfallsliknande beteende och onormal kalciumaktivitet, inklusive fler stora taggar och färre små taggar än vildtypsflugor. Kalciumaktiviteten var korrelerad till anfallsliknande beteende. Denna metod fungerar som en effektiv metod för att screena de patogena generna för epilepsi och utforska den potentiella mekanismen för epilepsi på cellnivå.
Introduction
Epilepsi, en komplex kronisk neurologisk sjukdom som kännetecknas av återkommande spontana och oprovocerade anfall och avvikande neuronal nätverksaktivitet, har drabbat över 70 miljoner individer över hela världen, vilket gör den till en av de vanligaste neurologiskasjukdomarna1 och leder till tunga bördor för familjer och samhälle. Med tanke på effekterna av epilepsi har många studier genomförts för att identifiera etiologin för anfall, varav genetik har godkänts som en primär orsak till många typer av epilepsi eller epileptiska syndrom2. Under de senaste årtiondena har framsteg inom genomisk teknik lett till en snabb ökning av upptäckten av nya epilepsiassocierade gener, som spelar en avgörande roll för anfallsförekomst, inklusive jonkanaler och icke-jonkanalgener 3,4. De bakomliggande mekanismerna och den funktionella analysen mellan generna och de epileptiska fenotyperna är dock ofullständigt klarlagda. Identifiering av epilepsiassocierade gener och mekanismer gör det möjligt att behandla patienter på ett effektivtsätt 5,6.
Cytosoliska kalciumsignaler är centrala element i neuronal aktivitet och synaptisk överföring. Kalciumavbildning, inklusive hjärnskivor7, in vivo 8,9 och ex vivo10, har använts för att övervaka neuronal aktivitet11 som en markör för neuronal excitabilitet sedan 1970-talet12,13. De senaste framstegen inom bildteknik, i kombination med de genetiskt kodade kalciumindikatorerna (GECI), såsom GCaMP6, har revolutionerat studiet av epilepsi på både hjärnövergripande och encellsupplösningsnivåer 14,15,16, som har en hög nivå av spatiotemporal precision. Förändringar i kalciumkoncentration och transienter observerades i aktionspotentialer respektivesynaptisk överföring 14, vilket indikerar att förändringen av intracellulära kalciumnivåer uppvisar en strikt korrelation med den elektriska excitabiliteten hos neuroner17,18. Kalciumavbildning har också tillämpats som en utvecklingsanfallsmodell9 och utförts på Drosophila för screening av antikonvulsiva föreningar19.
Drosophila melanogaster har vuxit fram som en kraftfull modellorganism i vetenskaplig forskning, såsom epilepsi, för sina sofistikerade molekylära genetik och beteendeanalyser 20,21,22. Dessutom har de avancerade genetiska verktygen hos Drosophila bidragit till uttrycket av den genetiskt kodade kalciumindikatorn GCaMP6. Till exempel möjliggör Gal4- och UAS-baserade binära transkriptionssystem specifikt uttryck av GCaMP6 på ett rumsligt och tidsmässigt kontrollerat sätt. Eftersom Drosophila är en liten organism kräver in vivo kalciumavbildning skickliga operationsfärdigheter för att utföra ett kirurgiskt ingrepp, där endast en liten del av hjärnans rygg exponerades genom ett litet fönster14,23. Samtidigt kan ex vivo kalciumavbildning i den intakta hjärnan hos Drosophila användas för att övervaka intresseområden (ROI) i hela hjärnan.
I denna studie presenterar vi ex vivo kalciumavbildning i GCaMP6-uttryckande vuxen Drosophila för att övervaka epileptiforma aktiviteter. CACNA1A är en välkänd epilepsigen tillhör cac Cav2-kanalen, som är en homolog till CACNA1A. Vi började med att dissekera hjärnorna hos cac knockdown-flugor tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi och avbilda dem med hjälp av ett konfokalmikroskop med xyt-skanningsläge. Vi analyserade sedan förändringarna i kalciumsignaler för ROI genom att beräkna indikatorer som kvantifierar spontana anfallsliknande händelser, såsom %ΔF/F-värde och kalciumhändelser av GCaMP6-fluorescens. Dessutom utförde vi mekanisk stimulans med virvelmaskin för att inducera anfallsbeteendetester på cac-knockdown-flugor samt för att validera resultaten av kalciumavbildning. Sammantaget ger detta protokoll ett värdefullt verktyg för att undersöka iktala händelser hos vuxna Drosophila genom ex vivo kalciumavbildning, vilket möjliggör utforskning av de potentiella mekanismerna för epilepsi på cellnivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalciumjonen fungerar som en avgörande andra budbärare och spelar en central roll i en rad fysiologiska och patofysiologiska svar på både kemiska och elektriska störningar. Dessutom har det topologiska elementet i de presynaptiska P/Q-kanalerna, som kodas av den mänskliga CACNA1A-genen, identifierats som ansvarigt för att förmedla urladdningen av olika neurotransmittorer, inklusive glutamat 30,31,32, och är nära kopplat till epilepsi</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (anslag nr 2022A1515111123 till Jing-Da Qiao) och planerar att förbättra vetenskaplig forskning inom GMU (Jing-Da Qiao). Detta arbete stöddes också av Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (Funding No. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
Referências
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genética. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
