Microdissectie en immunofluorescentiekleuring van myocardiale hulzen in longaders van muizen
Summary
Dit protocol demonstreert microscopiegeleide isolatie en immunofluorescentiekleuring van longaders van muizen. We bereiden weefselmonsters voor die het linker atrium, de longaders en de bijbehorende longen bevatten en kleuren ze voor cardiale troponine T en Connexin 43.
Abstract
Longaderen (PV’s) zijn de belangrijkste bron van ectopische slagen bij atriale aritmieën en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en progressie van atriale fibrillatie (AF). PV’s bevatten myocardiale hulzen (MS) die zijn samengesteld uit cardiomyocyten. MS zijn betrokken bij het initiëren en onderhouden van AF, omdat ze overeenkomsten behouden met het cardiale werkende myocardium, inclusief het vermogen om ectopische elektrische impulsen te genereren. Knaagdieren worden veel gebruikt en kunnen uitstekende diermodellen zijn om het myocardium van de longader te bestuderen, aangezien cardiomyocyten overal in de vaatwand aanwezig zijn. Nauwkeurige microdissectie en bereiding van muizen PV’s is echter een uitdaging vanwege de kleine orgaangrootte en ingewikkelde anatomie.
We demonstreren een microscopie-geleid microdissectieprotocol voor het isoleren van het linker atrium (LA) van de muizen samen met de PV’s. Immunofluorescentiekleuring met behulp van cardiale troponine-T (cTNT) en connexine 43 (Cx43) antilichamen wordt uitgevoerd om de LA en PV’s in volledige lengte te visualiseren. Beeldvorming met een vergroting van 10x en 40x biedt een uitgebreid beeld van de PV-structuur en gedetailleerde inzichten in de myocardiale architectuur, waarbij met name de aanwezigheid van connexine 43 in de MS wordt benadrukt.
Introduction
Boezemfibrilleren (AF) is de meest voorkomende aanhoudende aritmie1. De prevalentie van AF neemt nog verder toe met een verwacht aantal van ~17,9 miljoen patiënten in Europa in 20601. AF is klinisch zeer belangrijk omdat het een essentiële risicofactor is voor de ontwikkeling van een hartinfarct, hartfalen of beroerte, wat resulteert in een enorme individuele, sociale en sociaaleconomischelast. Hoewel AF al tientallen jaren bekend is, wordt de pathofysiologie van AF nog steeds niet volledig begrepen.
Al in de late jaren 1990 toonden studies de grote impact aan van longaders (PV’s) bij het initiëren en behouden van AF, aangezien ze de belangrijkste bron zijn van AF-triggerende ectopische slagen3. Het is aangetoond dat PV’s structureel verschillen van andere bloedvaten. Terwijl typische bloedvaten gladde spiercellen bevatten, bevatten de tunica media van PV’s ook cardiomyocyten4. Bij knaagdieren is deze hartmusculatuur alomtegenwoordig aanwezig in de hele PV’s, inclusief intra- en extrapulmonale delen, evenals in het openingsgebied5. Bij mensen bevatten PV’s ook cardiomyocyten, die kunnen worden waargenomen in verlengstukken van het linker atriale (LA) myocardium, de zogenaamde myocardiale mouwen (MS)6,7.
MS hebben morfologische overeenkomsten met het atriale myocardium8. De vorm en grootte van atriale en PV-cardiomyocyten verschillen niet significant tussen elkaar en vertonen vergelijkbare elektrofysiologische eigenschappen8. Elektrofysiologische opnames in de PV hebben de elektrische activiteit van MS bewezen, en angiografische beeldvorming heeft weeën onthuld die synchroon lopen met de hartslag 9,10.
Gap junctions zijn porievormende eiwitcomplexen die zijn samengesteld uit zes connexine-subeenheden, die de doorgang van ionen en kleine moleculen mogelijk maken11. Er bestaan gap-juncties in de cel-tot-cel-apposities, die naburige cardiomyocyten met elkaar verbinden en een intercellulaire elektrische koppeling tussen cardiomyocyten mogelijkmaken 12,13. Verschillende connexine-isovormen worden tot expressie gebracht in het hart, waarbij connexine 43 (Cx43) de meest voorkomende isovorm is die tot expressie komt in alle regio’s van het hart14. Eerdere studies leveren bewijs voor de expressie van Cx43 in cardiomyocyten van de PV’s15,16.
Het blijft een uitdaging om MS in intacte PV’s te onderzoeken vanwege hun delicate structuur, vooral in kleine diermodellen. Hier demonstreren we hoe PV’s samen met LA en longkwabben bij muizen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van microscopiegeleide microdissectie. Daarnaast demonstreren we immunofluorescentie (IF) kleuring van PV’s om cardiomyocyten en hun onderlinge verbindingen binnen de PV’s te visualiseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met dit protocol delen we een methode om de PV’s van het muizenhart te onderscheiden en te isoleren en er immunofluorescentiekleuring op uit te voeren. Na de orgaanoogst werden het hart en de longen uitgedroogd in een gesteriliseerde sucrose-oplossing, gevolgd door het scheiden van de ventrikels van het atrium en de longkwabben onder microscopische begeleiding. Daarna werd de hartbasis voorbereid om de PV’s te visualiseren, gevolgd door ze uit de longen te snijden bij het hilum. De daaropvolgende immunofluorescentiekleur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X3600221 aan H.V., 81X2600255 aan S.C.), de China Scholarship Council (CSC201808130158 aan R.X.), de Duitse Onderzoeksstichting (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 tot PT), en de Corona Foundation (S199/10079/2019 tot SC).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Referências
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
