Микродиссекция и иммунофлуоресцентное окрашивание рукавов миокарда в легочных венах мышей
Summary
Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.
Abstract
Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.
Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.
Introduction
Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией1. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до конца не изучена2.
Уже в конце 1990-х годов исследования продемонстрировали большое влияние легочных вен (ЛП) на инициацию и поддержание мерцательной аритмии, поскольку они являются основным источником эктопическихсокращений, вызывающих мерцательную аритмию. Показано, что ВВ структурно отличаются от других кровеносных сосудов. В то время как типичные кровеносные сосуды содержат гладкомышечные клетки, оболочка ВП также содержит кардиомиоциты4. У грызунов эта сердечная мускулатура повсеместно присутствует на протяжении всего ВП, включая внутри- и внелегочные отделы, а также область отверстия5. У человека ВП также содержат кардиомиоциты, которые можно наблюдать в расширениях миокарда левого предсердия (ЛП) — так называемых рукавах миокарда (МС)6,7.
Рассеянный склероз имеет морфологическое сходство с миокардом предсердий8. Форма и размер предсердий и кардиомиоцитов ВП существенно не различаются между собой и демонстрируют сопоставимые электрофизиологические свойства8. Электрофизиологические записи в ПВ доказали электрическую активность рассеянного склероза, а ангиографическая визуализация выявила сокращения, синхронизированные с сердцебиением 9,10.
Щелевые контакты представляют собой порообразующие белковые комплексы, состоящие из шести субъединиц коннексина, которые обеспечивают прохождение ионов и малых молекул11. Щелевые контакты существуют в межклеточных аппозициях, соединяют между собой соседние кардиомиоциты и обеспечивают межклеточное электрическое соединение между кардиомиоцитами12,13. В сердце экспрессируется несколько изоформ коннексина, причем коннексин 43 (Cx43) является наиболее распространенной изоформой, экспрессируемой во всех областях сердца14. Предыдущие исследования свидетельствуют об экспрессии Cx43 в кардиомиоцитах PV15,16.
По-прежнему сложно исследовать рассеянный склероз в интактных ФВ из-за их тонкой структуры, особенно на моделях мелких животных. В этой статье мы продемонстрируем, как идентифицировать и изолировать ВП вместе с ЛП и долями легких у мышей с помощью микродиссекции под контролем микроскопии. Кроме того, мы демонстрируем иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание ФВ для визуализации кардиомиоцитов и их взаимосвязей внутри ФВ.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей л?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), Китайским стипендиальным советом (CSC201808130158 R.X.), Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученого-клинициста в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.) и Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
Referências
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
