Dosage de l’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires
Summary
Nous décrivons ici un test interne d’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires. Des tests basés sur l’activité et des tests basés sur l’antigène ont été utilisés pour mesurer le facteur tissulaire dans les vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de plasma humain. Les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène.
Abstract
Le facteur tissulaire (TF) est un récepteur transmembranaire du facteur (F) VII et FVIIa. Le complexe TF/FVIIa initie la cascade de coagulation en activant à la fois FIX et FX. Le TF est libéré des cellules dans la circulation sous forme de vésicules extracellulaires (VE). Le niveau de VE TF-positif (+) est augmenté dans diverses maladies, y compris le cancer, les infections bactériennes et virales et la cirrhose, et est associé à la thrombose, à la coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité. Il existe deux façons de mesurer les VE TF+ dans le plasma : les tests basés sur l’antigène et l’activité. Les données indiquent que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène. Cet article décrit notre test d’activité EVTF interne basé sur un test de génération FXa en deux étapes. FVIIa, FX et calcium sont ajoutés aux échantillons contenant de l’EV TF+ pour générer de l’FXa en présence ou en l’absence d’anticorps anti-TF afin de distinguer la génération de FXa dépendante de la TF de la génération de FXa indépendante de la TF. Un substrat chromogène clivé par FXa est utilisé pour déterminer le niveau de FXa, tandis qu’une courbe standard générée avec un TF recombinant relipidé est utilisée pour la détermination de la concentration de TF. Ce test d’activité EVTF interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité TF commercial.
Introduction
La coagulation sanguine est initiée par la liaison du facteur (F) VII/VIIa au facteur tissulaire (TF)1. Le complexe TF/FVIIa active à la fois FIX et FX pour activer la coagulation sanguine1. Il existe deux formes de TF pleine longueur, liée à une membrane : cryptée et active. De plus, il existe une forme alternative d’épissage de TF (asTF). La sphingomyéline et la phosphatidylcholine dans le feuillet externe de la membrane cellulaire maintiennent la TF dans un état crypté 2,3,4. Lorsque les cellules sont activées ou endommagées, la phospholipide scramblase transfère la phosphatidylsérine et d’autres phospholipides chargés négativement dans le feuillet externe1. L’activation des cellules entraîne également la translocation de la sphingomyélinase acide vers le feuillet externe où elle dégrade la sphingomyéline en céramide5. Ces deux mécanismes convertissent le TF crypté en forme active. Il est également proposé que la protéine disulfure isomérase intervienne dans la formation de liaisons disulfure entre Cys186 et Cys209 dans TF crypté, ce qui entraîne le déchiffrement de TF 6,7,8. asTF est également présent dans la circulation mais n’a pas le domaine transmembranaire et est donc soluble 9,10. Il est important de noter que l’asTF a de très faibles niveaux d’activité procoagulante par rapport au TF10,11 actif sur toute sa longueur.
Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par les cellules hôtes au repos, activées et mourantes, ainsi que par les cellules cancéreuses12. Les VE expriment des protéines à partir de leurs cellules parentales12. Les VE actifs contenant du TF sont libérés par les monocytes activés, les cellules endothéliales et les cellules tumorales dans la circulation 13,14,15. Les niveaux de TF dans le plasma peuvent être mesurés par des tests basés sur l’activité et l’antigène. Les tests basés sur les antigènes comprennent l’ELISA et la cytométrie en flux16. Il existe deux tests différents basés sur l’activité : les tests d’activité TF en une et en deux étapes. Le test en une étape est basé sur un test de coagulation à base de plasma. L’échantillon contenant du TF est ajouté au plasma et le temps nécessaire à la formation d’un caillot est mesuré après recalcification. Le test en deux étapes mesure la génération FXa d’échantillons en ajoutant FVII ou FVIIa, FX et calcium. Les niveaux de FXa sont déterminés à l’aide d’un substrat clivé par FXa.
Dans les essais d’activité TF en une et deux étapes, la concentration de TF est déterminée à l’aide d’une courbe standard générée avec de la TF recombinante. Les tests en deux étapes ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests en une étape. De nombreuses études ont confirmé que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur les antigènes 17,18,19,20,21. De plus, notre test d’activité interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité commerciale22. Les individus en bonne santé ont des niveaux très faibles ou indétectables d’activité EVTF dans le plasma. En revanche, les personnes atteintes d’affections pathologiques, telles que le cancer, la cirrhose, la septicémie et l’infection virale, ont des niveaux détectables d’activité EVTF, ce qui est associé à une thrombose, à une coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité 23,24,25,26,27,28. Nous décrirons ici ce test d’activité EVTF en deux étapes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, le protocole de notre test d’activité EVTF interne est présenté. Il y a trois étapes critiques dans le protocole. Lors de la reconstitution de la pastille EV, il est important de pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV, même si elle n’est pas visible. Une reconstitution incomplète de la pastille EV entraînera un faux négatif ou une sous-estimation des valeurs d’activité EVTF des échantillons. Deuxièmement, l’utilisation de HBSA-Ca(+) est essentielle à l’étape 6.5 du protoco…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) et la chaire John C. Parker (N.M.). Nous tenons à remercier Mme Sierra J. Archibald pour ses commentaires utiles
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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