Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .

Resumo

As altas necessidades energéticas dos cérebros devido à atividade elétrica são uma de suas características mais distintivas. Esses requisitos são atendidos pela produção de ATP a partir da glicose e seus metabólitos, como os monocarboxilatos lactato e piruvato. Ainda não está claro como esse processo é regulamentado ou quem são os principais atores, particularmente em Drosophila.

Usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente, apresentamos um método simples para medir o transporte de monocarboxilatos e glicose em células gliais e neurônios em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila . O protocolo descreve como dissecar e aderir um cérebro larval expressando um dos sensores a uma lamínula de vidro.

Apresentamos os resultados de um experimento inteiro em que o transporte de lactato foi medido em cérebros de larvas derrubando transportadores monocarboxilatos previamente identificados em células gliais. Além disso, demonstramos como aumentar rapidamente a atividade neuronal e rastrear alterações de metabólitos no cérebro ativo. O método descrito, que fornece todas as informações necessárias, pode ser usado para analisar outros tecidos vivos de Drosophila .

Introdução

O cérebro apresenta elevadas necessidades energéticas devido ao alto custo de restauração de gradientes iônicos em neurônios causados pela geração e transmissão de sinais elétricos neuronais, bem como pela transmissão sináptica ^1,2. Há muito se pensa que essa alta demanda energética é atendida pela oxidação contínua da glicose para produzir ATP³. Transportadores específicos na barreira hematoencefálica transferem a glicose no sangue para o cérebro. Níveis glicêmicos constantes garantem que o cérebro receba um suprimento constante de glicose⁴. Curiosamente, cresce....

Protocolo

1. Manutenção de cepas volantes e sincronização larval

1. Para a realização desses experimentos, utilizaram-se culturas de moscas criadas a 25 °C em alimento padrão de Drosophila composto por 10% de levedura, 8% de glicose, 5% de farinha de trigo, 1,1% de ágar, 0,6% de ácido propiônico e 1,5% de metilparabeno.
2. Para seguir este protocolo, use as seguintes linhas: w¹¹¹⁸ (fundo de controle experimental), OK6-GAL4 (driver para neurônios motores), repo-GAL4 (driver para todas as células gliais), CG-GAL4 (driver para corpos gordos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII¹²Pglu700μδ6 (sensor de gli....

Resultados

Por até 1 h, esse procedimento permite a fácil medição de alterações intracelulares na fluorescência de sensores de monocarboxilato e glicose. Como mostrado na Figura 4, sensores lacônicos tanto nas células gliais quanto nos neurônios motores respondem a 1 mM de lactato em uma taxa semelhante no início do pulso, mas os neurônios motores atingem um aumento maior em relação à linha de base durante o pulso de 5 min, como demonstrado anteriormente¹⁷. Essa concentração de .......

Discussão

O uso do modelo de Drosophila para o estudo do metabolismo cerebral é relativamente novo²⁶, e tem sido demonstrado que ele compartilha mais características com o metabolismo de mamíferos do que o esperado, o que tem sido estudado principalmente in vitro em culturas de neurônios primários ou fatias cerebrais. Drosophila se destaca em experimentos in vivo graças à bateria de ferramentas genéticas e sensores codificados geneticamente disponíveis que permitem aos pe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu-Cell-R
Software
	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Driver de corpo gordo
Dumont # 5 Fórceps	Fine Science Tools	11252-30
Sistema de divisão de emissão DV2	Lamínulas fotométricas	de
vidro (25 mm de diâmetro)	Marienfeld	111650	Alemanha
Glicose	Sigma	G8270
GraphPad Prisma GraphPad	Software	Versão 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
Software ImageJ	National Institues of Health	Versão 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 objetiva de imersão em água
	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Driver de neurônio motor
Picrotoxina	Sigma	P1675S	CUIDADO-Fatal se ingerido
Poly-L-lisina	Sigma	P4707
Ácido propiônico	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Driver de célula glial (todos)
Lactato de Sódio	Sigma	71718
Piruvato de Sódio	Sigma	P2256
Microscópio de fluorescência de disco giratório BX61WI	Olympus-Sucrose
	Sigma	S0389
Trealose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Centro de Estoque de Drosophila de Kyoto	117012	Sensor ATP
UAS-Chk RNAi GD1829	Centro de Recursos de Drosophila de Viena	v37139	Linha Chk RNAi
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Sensor de glicose
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Sensor de cálcio
UAS-Laconic	Sierralta Lab-Sensor	de	lactato
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 objetiva de imersão em água	Olympus	-

Olympus-CG-GAL4 Olympus-Metilparabeno