Övergående mellersta cerebral artärocklusion Modell för stroke
Summary
Detta protokoll beskriver modellen för övergående fokal cerebral ischemi hos möss genom intraluminal ocklusion av den mellersta hjärnartären. Dessutom visas exempel på resultatbedömning med hjälp av magnetisk resonanstomografi och beteendetester.
Abstract
Stroke är en av de vanligaste orsakerna till dödsfall eller kroniska funktionshinder globalt. Befintliga optimala behandlingar är dock begränsade till reperfusionsbehandlingar under den akuta fasen av ischemisk stroke. För att få insikter i strokefysiopatologi och utveckla innovativa terapeutiska metoder spelar in vivo-modeller av stroke för gnagare en grundläggande roll. Tillgången på genetiskt modifierade djur har särskilt drivit på användningen av möss som experimentella strokemodeller.
Hos strokepatienter är ocklusion av den mellersta hjärnartären (MCA) vanligt förekommande. Följaktligen involverar den vanligaste experimentella modellen intraluminal ocklusion av MCA, en minimalt invasiv teknik som inte kräver kraniektomi. Denna procedur innebär att man för in ett monofilament genom den yttre halspulsådern (ECA) och för det genom den inre halspulsådern (ICA) tills det når MCA:s förgreningspunkt. Efter en 45 minuters arteriell ocklusion avlägsnas monofilamentet för att möjliggöra reperfusion. Under hela processen övervakas det cerebrala blodflödet för att bekräfta minskningen under ocklusion och efterföljande återhämtning vid reperfusion. Neurologiska och vävnadsmässiga resultat utvärderas med hjälp av beteendetester och magnetisk resonanstomografi (MRT).
Introduction
Stroke är en förödande sjukdom som drabbar cirka 15 miljoner människor världen över årligen, enligt WHO. Ungefär en tredjedel av patienterna dukar under för tillståndet, medan ytterligare en tredjedel upplever permanent funktionsnedsättning. Stroke är en komplex patologi som involverar olika celltyper, såsom neurala och perifera immunceller, kärl och systemiska reaktioner1. Det intrikata nätverk av reaktioner som utlöses av stroke på systemnivå kan för närvarande inte replikeras med hjälp av in vitro-modeller . Experimentella djurmodeller är därför viktiga för att fördjupa sig i sjukdomens mekanismer och för att utveckla och testa nya terapier. För närvarande är tidig vävnadsreperfusion den enda godkända interventionen, antingen genom trombolys med plasminogenaktivator av vävnadstyp (tPA) eller endovaskulär trombektomi1.
Ocklusioner av den mellersta hjärnartären (MCA) är vanliga hos strokepatienter. Följaktligen utvecklades gnagarmodeller för transient MCA-ocklusion (tMCAo) initialt på råtta 2,3,4. Numera är genetiskt modifierade möss de vanligaste djuren i experimentella strokemodeller. I denna studie beskriver vi en minimalt invasiv modell av intraluminal tMCAo i möss. Tillvägagångssättet utförs via halspulsådern på halsnivå, utan kraniektomi.
Ocklusionsperiodens varaktighet är en kritisk faktor som avgör omfattningen av den ischemiska lesionen. Även korta ocklusioner på 10 minuter kan orsaka selektiv neuronal död utan en uppenbar infarkt, medan längre ocklusioner, som vanligtvis varar 30 till 60 minuter, resulterar i en viss grad av hjärninfarkt. Till skillnad från de proximala och distala grenarna av MCA som försörjer cortex och har kollateraler, saknar de lenticulo-striatala artärerna som ger blod till striatum kollateraler5. Som en konsekvens av detta sker en större minskning av blodflödet i striatum än i cortex efter tMCAo. Ocklusioner på 30 minuter eller mindre påverkar i allmänhet striatum men inte cortex, medan längre ocklusioner, från 45 minuter och framåt, ofta genererar en ischemisk lesion i hela MCA-territoriet, inklusive striatum och dorsolaterala cortex.
För att säkerställa mössens välbefinnande ger vi smärtstillande läkemedel före ingreppet och använder bedövning under operationen. Icke desto mindre kan anestesi potentiellt introducera artificiella förändringar i musens fysiologi och påverka vissa utfallsmått6. Det kirurgiska ingreppet, när det utförs av erfaren personal, varar vanligtvis cirka 15 minuter för att inducera MCAo. Därefter beror den totala tiden under anestesi på ocklusionsperioden. För experiment där minimering av anestesi är avgörande, innebär ett alternativt steg i proceduren att avbryta anestesi under ocklusionsperioden och begränsa den endast till de kirurgiska stegen för att sätta in och dra ut filamentet som blockerar MCA. Detta tillvägagångssätt minskar anestesiens varaktighet och minimerar dess potentiella artefaktiska effekter på den experimentella modellen 7,8. Därför presenteras metoden för att inducera övergående fokal ischemi genom intraluminal ocklusion av MCA med två varianter: med musen bedövad under hela ocklusionsperioden eller med musen vaken under denna period. I båda fallen bör en skenoperation utföras parallellt med ingreppet på de ischemiska mössen. Dessutom tillhandahålls data om resultatbedömning mätt med beteendetester och MRT vid olika tidpunkter efter reperfusion. Slutligen diskuteras de viktigaste faktorerna att ta hänsyn till vid implementering av den experimentella proceduren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraluminala tMCAo-proceduren är den mest använda modellen för fokal hjärnischemi med reperfusion inom grundforskning. För närvarande är möss den föredragna djurmodellen på grund av tillgången på genetiskt modifierade stammar. Det är dock viktigt att erkänna att genetiskt modifierade möss och deras genetiska bakgrund kan påverka hjärnans vaskularisering. Förekomsten av kollateral cirkulation och anastomoser mellan olika artärterritorier kan avsevärt påverka resultaten av experimentella procedure…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studie med stöd av anslag PID2020-113202RB-I00 finansierat av Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 och “Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF). Ett sätt att skapa Europa”. NCC och MAR hade predoktorala stipendier (PRE2021-099481 respektive PRE2018-085737) finansierade av MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 och av “European Social Fund (ESF) Investing in your future”. Vi tackar Francisca Ruiz-Jaén och Leonardo Márquez-Kisinousky för deras tekniska support. Vi tackar för stödet från MRI-avbildningsanläggningen vid Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) Program of Generalitat de Catalunya stöder IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
Referências
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
