Приготовление одноклеточной суспензии из сонных артерий мыши для секвенирования одноклеточных клеток
Summary
Здесь мы опишем двухэтапный протокол клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонных артерий мыши.
Abstract
Сонные артерии являются основными кровеносными сосудами в шее, которые снабжают кровью и кислородом мозг, но стеноз сонной артерии возникает, когда сонные артерии закупориваются бляшками. Выявление клеточного состава сонной артерии на одноклеточном уровне имеет важное значение для лечения атеросклероза сонной артерии. Однако готового к применению протокола приготовления одноклеточных суспензий из сонных артерий не существует. Чтобы получить подходящий протокол диссоциации нормальных сонных артерий на уровне одной клетки с меньшим повреждением клеток, мы разработали двухступенчатый метод расщепления путем интеграции процесса расщепления коллагеназы/ДНКазы и трипсина. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных одной клетки в каждой клетке сонной артерии было обнаружено медиана ~2500 транскриптов на клетку. Примечательно, что различные типы клеток нормальной сонной артерии, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs), были обнаружены одновременно. Этот протокол может быть применен для приготовления одноклеточной суспензии кровеносных сосудов из других тканей с соответствующими модификациями.
Introduction
Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, связанное с такими факторами риска, как высокое кровяное давление, гиперлипидемия и гемодинамика1. Бифуркации сонных артерий склонны к гемодинамическим изменениям и приводят к образованию сонных бляшек. Клиническая картина атеросклероза сонных артерий может быть острой, такой как инсульт и транзиторная ишемия головного мозга, или хронической, такой как рецидивирующая транзиторная ишемия головного мозга и сосудистая деменция2. Механически бляшка на сонной артерии является результатом взаимодействия между клетками стенки различных сосудов и различными клетками крови при патологических состояниях. Поэтому выявление одноклеточного атласа сонных сосудов в физиологических и патологических условиях особенно важно для профилактики и лечения развития каротидных бляшек.
Секвенирование одноклеточной РНК является одной из самых мощных технологий биологических исследований из-за ее сверхвысокого разрешения и обнаружения клеточной гетерогенности от одного и того же типа клеток организмов 3,4. Исследователи использовали секвенирование одноклеточной РНК для проведения исследований во многих областях, таких как сердечно-сосудистые заболевания5 и рак6. Тем не менее, быстрое и точное разделение тканей на отдельные клетки по-прежнему остается одной из основных задач. Ферментативная диссоциация является широко используемым методом, который преимущественно включает коллагеназу, папаин, трипсин, ДНКазу и гиалуронидазу. В частности, коллагеназы являются основными видами ферментов для пищеварения отдельных клеток, в основном гидролизующих компоненты коллагена в соединительных тканях. Различные типы коллагеназ применимы для диссоциации различных тканей, таких как молочная железа7, клубочек8, иридокорнеальный угол9, коленный сустав10, аорта11 илегкое 12. Из-за уникальных физиологических свойств различных тканей диссоциация с использованием одного и того же метода может вызвать множество проблем при получении одиночных клеток, таких как низкая жизнеспособность клеток, низкое количество клеток и крупный клеточный мусор. Поэтому изобретение методов пищеварения для различных тканей имеет важное значение для получения высококачественных одноклеточных суспензий.
Этот протокол направлен на разработку двухэтапного метода клеточного пищеварения для приготовления одноклеточной суспензии сонной артерии мышей дикого типа. В соответствии с особенностями сонной артерии мы объединили коллагеназу/ДНКазу с трипсином для получения высококачественной одноклеточной суспензии сонной артерии мыши, поскольку коллагеназа может гидролизовать коллаген сонных тканей, который в дальнейшем переваривался трипсином в одноклеточную суспензию. Для определения жизнеспособности и концентрации клеток использовали подсчет двойной флуоресценции акридина оранжевого/пропидия (AO/PI), и было обнаружено, что одноклеточная суспензия удовлетворяет требованиям к секвенированию одиночных клеток, с жизнеспособностью клеток более 85% и высокой концентрацией клеток. После обработки данных отдельных клеток в нормальных сонных артериях мышей после пищеварения были идентифицированы четыре типа клеток, включая гладкомышечные клетки сосудов (VSMC), фибробласты, эндотелиальные клетки (EC), а также макрофаги и дендритные клетки (Mφ/DCs). Преимущества данного протокола заключаются в том, что: 1) можно идентифицировать несколько типов клеток в сонной артерии, 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется, и 3) его можно легко повторить без специального оборудования. Этот протокол подходит для исследователей, которые заинтересованы в изучении одноклеточной мультиомики сонных артерий мышей. Этот протокол также может быть полезен при диссоциации других кровеносных сосудов с соответствующими модификациями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим подробный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из сонной артерии мышей дикого типа, в котором был сконструирован двухстадийный метод пищеварения, интегрирующий процесс пищеварения коллагеназы/ДНКазы и трипсина. После проверки качеств…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук Китая (82070450 для К.Т. и 82170466 для Л.З.) и стипендией Китайского фонда постдокторантуры (7121102223 для Ф.Л.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
Referências
- Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -. F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
