Motorlu bir cihaz kullanarak tek hücre analizi için dokuların mekanik ayrışması
Summary
Akış sitometrisi gibi aşağı akış analizleri için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak üzere dokuların kombine enzimatik ve yarı otomatik mekanik ayrışması için genel bir protokol sağlanır. Bu protokol için geliştirilen düşük maliyetli mekanik cihazın imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar dahildir.
Abstract
Doku örneklerinin analizi için tek hücreleri izole edebilmek ve hazırlayabilmek, yeni biyomedikal keşifler ve araştırmalar için hızla önemli hale geldi. Tek hücreli izolasyonlar için manuel protokoller oldukça zaman alıcıdır ve kullanıcı değişkenliğine eğilimlidir. Otomatik mekanik protokoller, işlem süresini ve numune değişkenliğini azaltabilir, ancak daha düşük kaynaklı araştırma ortamlarında kolayca erişilebilir veya uygun maliyetli değildir. Burada açıklanan cihaz, akademik laboratuvarlar için düşük maliyetli bir alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen malzemeler kullanılarak yarı otomatik doku ayrışması için tasarlanmıştır. Cihaz tasarımının imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar sağlanmıştır. Ayrışma protokolü, birden fazla fare dokusunda manuel preparatlarla karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı ile güvenilir bir şekilde tek hücreli süspansiyonlar üretir. Protokol, cihaz başına aynı anda 12 adede kadar doku örneğini işleme yeteneği sağlayarak büyük örnek boyutları gerektiren çalışmaları daha yönetilebilir hale getirir. Eşlik eden yazılım ayrıca, değişen dokulara ve deneysel kısıtlamalara uyum sağlamak için cihaz protokolünün özelleştirilmesine de izin verir.
Introduction
Tek hücreli analiz, akış sitometrisi, farklı hücre tiplerinin tanımlanması, tek hücre dizilimi veya hücreler arasındaki genomik veya transkriptomik varyasyonların tanımlanması gibi uygulamalar için yeni biyomedikal keşifler için hızla önemli hale gelmiştir1. İlgilenilen dokulardan bu tür hücre izolasyonlarının gerçekleştirilmesi, disseke edilmiş dokuların kıyılmasını ve istenen hücrelerden bağ dokusunu filtrelemek için ince bir hücre süzgecinden itilmesini gerektirir (Şekil 1A). Dendritik hücreler veya makrofajlar veya özellikle fibröz dokulardan hücreler gibi yapışık hücre tiplerinin izole edilmesi, ek mekanik veya enzimatik ayırma adımları gerektirir 2,3,4. Bu işlem genellikle manuel olarak yapılır, bu da hücre verimlerini ve numune canlılığını değerlendirirken oldukça zaman alıcı ve kullanıcı değişkenliğine eğilimli hale getirir. Bu nedenle, otomatik doku ayrışması için özelleştirilebilir seçenekler sunmak çok önemlidir. Bu tür sistemleri tasarlamak için bazı girişimlerde bulunulmuş olsa da, büyük ölçüde bu cihazların maliyet engelleyici doğası nedeniyle, özellikle akademik laboratuvarlarda ve daha düşük kaynak ortamlarında mevcut seçeneklere her zaman kolayca erişilememektedir5. Ayrıca, bu cihazlar her zaman bir araştırma grubunun bireysel ihtiyaçlarına göre özelleştirilemez6.
Burada, sindirim enzimleri ve mekanik bozulma yardımıyla tüm dokuların veya doku parçalarının tek hücreli süspansiyonlara sindirimini otomatikleştirmek için bir doku ayrıştırıcı cihaz tasarlandı. Bu cihaz laboratuvarda kolayca monte edilebilir, sıcaklık regülasyonu için ısıtma veya soğutma odalarına yerleştirilebilir, gerekli sayıda dokunun ayrışması için özelleştirilebilir ve istenen ayrışma protokolleri ile programlanabilir. Bu cihazın geniş kullanımı, hücre ekstraksiyon protokollerinin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırabilir ve manuel ayrışmaya zaman kazandıran bir alternatif sağlayabilir.
Tasarım, otomatik bir işlemle 12 dokuya kadar aynı anda sindirime izin verir. Cihaz, paralel olarak bağlanmış ve motorların dönüşünü/hızını kontrol etmek için ayarlanabilir voltaj kadranlı bir AC/DC adaptör aracılığıyla standart bir duvar prizi ile çalışan 12 ayrı motordan oluşur. Motorlar, C-boruların üst kısmına sıkıca oturan altıgen bir cıvatayı döndürür. C-tüpleri, motorların sabitlendiği üst plakaya her iki taraftan kilitlenen akrilik bir plaka üzerinde aşağı doğru gerilimle yerinde tutulur (Şekil 1B). Motorlar paralel olarak bağlandığından, herhangi bir voltajdaki hızları çok fazla değişmemelidir, ancak voltaj sabit tutulduğunda bile yük (cihaza monte edilen C-tüplerinin sayısı) hızı etkileyecektir. Dakikadaki dönüşleri (rpm) ölçmek için, bir hall etkisi sensörü ve motor millerinden birine sabit bir mıknatıs kullanılarak bir takometre dahil edilmiştir (Ek Şekil 1). Motor dizileri oluşturmak için CAD dosyaları Ek Kodlama Dosyası 1’de sağlanır. Ayrıca, motorlara iletilen pozitif/negatif yükleri tersine çevirerek dönüş yönünü tersine çevirmek için programlanabilir bir anahtar da dahildir. Tüm bu özellikler, bir Arduino Nano (Ek Kodlama Dosyası 2) üzerinde kodlanmış yazılım (Arduino IDE yazılımı, Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak entegre edilmiştir. Bağlı düğmeleri ve bir LCD paneli (Ek Şekil 2) kullanarak, kaydedilmiş ve özel protokoller oluşturmak ve çalıştırmak, bir protokolün belirli zamanlarında dönüş yönünü otomatik olarak tersine çevirmek, voltajı kullanarak hızı ayarlamak (Ek Şekil 3) ve programlanmış bir protokolü tamamlamak için mevcut motor hızını ve kalan süreyi görüntülemek mümkündür (Ek Şekil 4).
Bu çalışma için, hem bu cihazla mekanik-enzimatik doku ayrışması hem de manuel-enzimatik doku ayrışması kullanılarak, aşağı akış uygulamaları için geri kazanılan hücrelerdeki farklılıkları belirlemek için tek hücreli süspansiyonlar hazırlandı. Hücre preparatları, doku başına toplam hücre verimine ve hücre canlılığı yüzdesine göre değerlendirildi. Yüzey marker ekspresyonundaki potansiyel farklılıkları karşılaştırmak için akış sitometrisi kullanıldı. Veriler grafik ve istatistiksel analiz programları kullanılarak analiz edilmiştir. Örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşlenmemiş Welch t-testleri kullanıldı ve örneklem büyüklükleri n > 4 fareyi temsil eden 2 tekrarlanan deney kullanıldı. Bu cihazın imalatı ve montajı için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 1’de bulunabilir. Bu protokol için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu cihaz, sonraki tek hücreli analiz için tüm dokulardan tek hücreli süspansiyonlar sağlamak üzere araştırma ortamında kolay montaj için tasarlanmıştır. Özellikler, temel olmakla birlikte, akademik ortamlarda ve ötesinde araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için yeterlidir. Bu cihazı kullanmanın önemli bir yararı, değişkenliği azaltarak tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasını iyileştirme potansiyelidir. Ek olarak, 12+ numuneyi aynı anda işleme yeteneği, numuneden numune…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fischell Biyomühendislik Bölümü (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Vakfı (KM) ve Amerikan Akciğer Derneği’nden (KM) fon alındı. Yazarlar, düzenleme konusundaki yardımları için Michele Kaluzienski’ye teşekkür etmek istiyor.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
Referências
- Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
- Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).
- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).
- McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
- Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).
- Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
- Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
- Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
- Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333 (2020).
