Um protocolo é apresentado para avaliar se pequenos EVs (sEVs) isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) rompem a barreira hematoencefálica em camundongos fêmeas adultas não grávidas.
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Artigo de método
Ruptura da Barreira Hematoencefálica de Camundongos por Pequenas Vesículas Extracelulares de Placentas Humanas Hipóxicas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As complicações cerebrovasculares, incluindo edema cerebral e acidente vascular cerebral isquêmico e hemorrágico, constituem a principal causa de mortalidade materna associada à pré-eclâmpsia. Os mecanismos subjacentes dessas complicações cerebrovasculares permanecem obscuros. No entanto, eles estão ligados à disfunção placentária e à interrupção da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, a conexão entre esses dois órgãos distantes ainda está sendo determinada. Evidências crescentes sugerem que a placenta libera moléculas sinalizadoras, incluindo vesículas extracelulares, na circulação materna. As vesículas extracelulares são categorizadas de acordo com seu tamanho, sendo que pequenas vesículas extracelulares (sEVs menores que 200 nm de diâmetro) são consideradas partículas sinalizadoras críticas em condições fisiológicas e patológicas. Na pré-eclâmpsia, há um aumento do número de EVs circulantes na circulação materna, cuja função de sinalização não é bem compreendida. Os EVs placentários liberados na pré-eclâmpsia ou em placentas gestacionais normais expostas à hipóxia induzem disfunção endotelial cerebral e interrupção da BHE. Neste protocolo, avaliamos se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) interrompem a BHE in vivo.
Introdução
Aproximadamente 70% das mortes maternas por pré-eclâmpsia, síndrome hipertensiva da gravidez caracterizada por processos de placentação prejudicados, disfunção endotelial sistêmica materna e, em casos graves, falência de múltiplos órgãos 1,2, estão associadas a complicações cerebrovasculares agudas 3,4. A maioria das mortes maternas ocorre em países de baixa e médiarenda5. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão claros, apesar da relevância clínica e epidemiológica das complicações cerebrovasculares associadas à pr....
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Protocolo
A pesquisa foi realizada seguindo os princípios expressos na Declaração de Helsinque e sob autorização dos respectivos Comitês de Ética em Pesquisa. Todos os participantes humanos deram seu consentimento informado antes da coleta da amostra, conforme relatado anteriormente25. Adicionalmente, o Comitê de Bioética e Biossegurança da Universidade Bío-Bío aprovou este projeto (bolsa Fondecyt 1200250). O trabalho com animais foi conduzido de acordo com os princípios cardeais dos três R's no uso de animais em experimentação35, e de acordo com as recomendações das diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório public....
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Resultados
Este protocolo avalia a capacidade de sEVs derivados de placentas cultivadas em hipóxia para interromper a BBB em camundongos não gestantes. Este método permite compreender melhor a conexão potencial entre a placenta e o cérebro em condições normais e patológicas. Em particular, este método pode constituir um proxy para analisar a participação de EVs placentárias no aparecimento de complicações cerebrais na pré-eclâmpsia.
Ao contrário dos camundongos injetados com sEVs-Nor, os camundongos inje.......
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Discussão
Este estudo revela novos insights sobre danos potenciais resultantes de sEVs isolados de explantes placentários cultivados em condições hipóxicas sobre o rompimento da barreira hematoencefálica de roedores. O mecanismo patológico envolve a redução do CLND-5 na região posterior do cérebro25.
Investigações prévias revelaram que os sEVs plasmáticos de indivíduos com pré-eclâmpsia induzem disfunção endotelial em vários órgãos usando modelos in vitro
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Divulgações
Os autores declaram não haver qualquer conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos pesquisadores da GRIVAS Health pela valiosa contribuição. Além disso, as parteiras e o corpo clínico do Serviço de Obstetrícia e Ginecologia pertencem ao Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de cérebro de camundongos adultos impressa em 3D | Arquivo de acesso aberto | Camundongos adultos | Fatiador de cérebro de camundongos adultos. Impresso em filamento PLA. |
| Anticorpo primário anti-β-actina | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Anticorpo para controle de carga (Western blot) |
| Anticorpo primário anti-Claudin5 | Santa cruz Biotecnologia | sc-374221 | Anticorpo primário para proteína de junção apertada CLDN5 de camundongos BBB (Western blot) |
| Kit de proteína BCA | Thermo Scientific | 23225 | Kit para medir a concentração de proteínas |
| Meios de cultura #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Meio de cultura para explantes placentários |
| D180 CO2 incubadora | RWD Ciências da vida | D180 | Incubadora padrão para estabilizar explantes e cultura sEVs-Nor |
| Evans corante azul > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Corante para analisar a ruptura da barreira hematoencefálica IN VIVO |
| Soro fetal bovino 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Fator de crescimento aditivo para meios de cultura 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge para meios condicionados > 1,20,000 x g |
| Software ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurano x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Agente de anestesia inalada volátil para camundongos |
| Kit CellTiter 96 Não radioativo | Promega | 0000105232 | In vitro ensaio para viabilidade de explantes placentários |
| Camundongo IgG Anticorpo secundário | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Anticorpo secundário para CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Análise de nanorastreamento de partículas de explantes placentários meios condicionados |
| Paraformaldehide E solução a 97% 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Solução fixadora para fatias de tecido cerebral e perfusão intracárdica (uma vez diluída) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | Solução de | lavagem 10010023 para explantes de placenta |
| Penicilina-estreptomicina 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobióticos para explantes placentários meios |
| de culturaProOX C21 Citocêntrico O2 e CO2 Controlador de subcâmara | BioSpherix | SCR_021131 | regulador de CO2 para induzir hipóxia em câmara selada para sEVs-Hyp |
| Tiopental sódico 1 g | Chemie | 7061 | agente humanitário de eutanásia |
| Sistema de anestesia de baixo fluxo Somnosuite | Kent Scientifics | SS-01 | Vaporizador de isoflurano para pequenos roedores |
| Plataforma de aquecimento cirúrgico | Kent Scientifics | A41166 | Plataforma de aquecimento para manutenção de anestesia em camundongos |
| Filtros de seringa, Politetrafluoretileno (PTFE), Hidrofóbico, 0,22 µ m, Estéril, 25 mm | Material de laboratório do sul | 10026 | Filtração de meios condicionados colhidos de explantes placentários |
| Micro Centrífugas de Alta Velocidade de Mesa HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Centrifugações seriais de meios condicionados < 1,20, 000 x g |
| Estereomicroscópio trinocular transmitido e luz reflexiva 10x-160x | Centro Médico | 2597 | Estereomicroscópio para registrar fatias de cérebro |
Referências
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (200....
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Reimpressões e permissões
