단일 탱크에서 행동 테스트 배터리를 사용한 성인 Danio rerio 의 신경 독성 평가
Summary
여기에서는 단일 수조를 사용하여 성체 제브라피쉬에 대한 화학 물질(예: 메스암페타민 및 글리포세이트)의 잠재적인 신경 독성 영향을 효과적으로 결정하기 위해 새로운 수조, Shoaling 및 사회적 선호도 테스트를 포함한 포괄적인 행동 테스트 배터리를 제시합니다. 이 방법은 신경 독성 및 환경 연구와 관련이 있습니다.
Abstract
신경 병리학적 효과의 존재는 수년 동안 화학 물질의 신경 독성을 평가하기 위한 주요 종점임이 입증되었습니다. 그러나 지난 50년 동안 화학 물질이 모델 종의 행동에 미치는 영향은 적극적으로 조사되었습니다. 점진적으로 행동 종점이 신경독성학적 스크리닝 프로토콜에 통합되었으며, 이러한 기능적 결과는 이제 화학물질의 잠재적인 신경독성을 식별하고 결정하는 데 일상적으로 사용됩니다. 성체 제브라피시의 행동 분석은 불안, 사회적 상호 작용, 학습, 기억 및 중독을 포함한 광범위한 행동을 연구할 수 있는 표준화되고 신뢰할 수 있는 수단을 제공합니다. 성체 제브라피쉬의 행동 분석에는 일반적으로 물고기를 실험장에 배치하고 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 행동을 기록 및 분석하는 것이 포함됩니다. 물고기는 다양한 자극에 노출될 수 있으며 다양한 지표를 사용하여 행동을 정량화할 수 있습니다. 새로운 수조 테스트는 물고기의 불안과 같은 행동을 연구하기 위해 가장 널리 받아들여지고 널리 사용되는 테스트 중 하나입니다. 떼를 지어 다니고 사회적 선호도 테스트는 제브라피쉬의 사회적 행동을 연구하는 데 유용합니다. 이 분석은 전체 떼의 거동을 연구하기 때문에 특히 흥미롭습니다. 이러한 분석은 재현성이 높고 약리학적 및 유전자 조작에 민감한 것으로 입증되어 행동의 기저에 있는 신경 회로와 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구가 되었습니다. 또한 이러한 분석은 약물 스크리닝에 사용되어 행동의 잠재적 조절제일 수 있는 화합물을 식별할 수 있습니다.
이 연구에서는 기분전환용 약물인 메스암페타민(methamphetamine)과 환경오염물질인 글리포세이트(glyphosate)의 영향을 분석하면서 어류 신경독성학에 행동 도구를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 결과는 신경 기능을 변화시킬 수 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 환경 오염 물질 및 약물의 신경 독성학적 영향을 이해하는 데 성인 제브라피쉬의 행동 분석이 크게 기여했음을 보여줍니다.
Introduction
제브라피시(Danio rerio)는 생태독성학, 약물 발견 및 안전성 약리학 연구에서 인기 있는 척추동물 모델 종입니다. 저렴한 비용, 잘 정립된 분자 유전 도구, 신경계의 형태 형성 및 유지에 관여하는 주요 생리학적 과정의 보존으로 인해 제브라피시는 신경 행동 독성학을 포함한 신경 과학 연구에 이상적인 동물 모델입니다 1,2. 화학 물질의 신경 독성을 평가하기위한 주요 종점은 최근까지 신경 병리학 적 영향의 존재였습니다. 그러나 최근에는 행동 종점이 신경독성학적 스크리닝 프로토콜에 통합되었으며, 이러한 기능적 결과는 이제 화학물질의 잠재적인 신경독성을 식별하고 결정하는 데 일반적으로 사용됩니다 3,4. 더욱이, 어류의 매우 경미한 행동 변화조차도 자연 조건에서 동물의 생존을 위태롭게 할 수 있기 때문에 행동 종점은 생태학적 관점에서 매우 관련성이 높다5.
성체 제브라피시 연구에서 가장 많이 사용되는 행동 분석 중 하나는 불안과 유사한 행동을 측정하는 새로운 수조 테스트(NTT)입니다 6,7. 이 분석에서 물고기는 새로움(물고기가 낯선 수조에 놓임), 가벼운 혐오 자극에 노출되고 행동 반응이 관찰됩니다. NTT는 주로 물고기의 기초 운동 활동, 지오택시, 동결 및 불규칙한 움직임을 평가하는 데 사용됩니다. 불규칙한8은 갑작스런 방향 전환(지그재그)과 반복되는 가속(다팅)이 특징입니다. 그것은 경보 반응이며 일반적으로 동결 에피소드 전후에 관찰됩니다. 동결 행동은 수조 바닥에 있는 동안 물고기의 움직임(수술 및 안구 운동 제외)이 완전히 멈추는 것에 해당하며, 진정으로 인한 부동성과 구별되며, 이는 저운동, 무감각증 및 침몰을 유발합니다8. 얼어붙는 것은 일반적으로 높은 스트레스 및 불안 상태와 관련이 있으며 복종하는 행동의 일부이기도 합니다. 복잡한 행동은 동물의 불안 상태를 나타내는 훌륭한 지표입니다. NTT는 약리학적 및 유전자 조작에 민감한 것으로나타났으며9 불안 및 관련 장애의 신경 기초를 연구하는 데 유용한 도구가 되었다.
제브라피시는 매우 사회적인 종이기 때문에 다양한 사회적 행동을 측정할 수 있습니다. 숄링 테스트(shoaling test, ST)와 사회적 선호도 테스트(social preference test, SPT)는 사회적 행동을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 분석법이다10. ST는 물고기의 공간적 행동과 움직임 패턴을 정량화하여11 물고기가 함께 그룹화하는 경향을 측정합니다. ST는 집단 역동성, 리더십, 사회적 학습을 연구하고 많은 어종의 사회적 행동을 이해하는 데 유용하다12. 성체 제브라피쉬의 SPT는 생쥐13에 대한 사회적 신규성 테스트에 대한 크롤리의 선호도에서 채택되었으며, 이 모델 종14의 사회적 상호작용 연구를 위한 인기 있는 행동 분석법이 되었다. 이 두 가지 검사는 또한 약물 스크리닝 분석에 사용하기 위해 조정되었으며 사회적 행동을 조절하는 새로운 화합물을 식별하기 위한 가능성을 보여주었습니다 15,16.
일반적으로, 성체 제브라피쉬의 행동 분석은 활성 화합물 및 남용 약물의 행동 메커니즘 또는 신경 표현형에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있는 강력한 도구이다17. 이 프로토콜은 기초 물질 자원으로 이러한 행동 도구(behavioral tools)7 를 구현하는 방법과 광범위한 신경 활성 화합물의 효과를 특성화하기 위해 독성 분석에 적용하는 방법을 상세히 설명한다. 또한 신경 활성 화합물(메스암페타민)에 대한 급성 노출의 신경 행동 효과를 평가하기 위해 동일한 테스트를 적용할 수 있을 뿐만 아니라 살충제(글리포세이트)의 환경 농도에 만성적으로 노출된 후 이러한 영향을 특성화할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTT에서 관찰된 특징적인 불안 행동은 뇌에서 분석된 세로토닌 수치와 양의 상관관계가 있다21. 예를 들어, 5-HT 생합성 억제제인 파라-클로로페닐알라닌(PCPA)에 노출된 후, 물고기는 양성 지오택시와 뇌 5-HT 수치 감소를 나타냈으며, 이는 METH로 얻은 결과와 매우 유사했다22. 따라서 뇌 세로토닌 수치의 감소와 METH에 노출된 제브라피시에서 양성 지오택시가 나타나…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 스페인 과학혁신부(프로젝트 PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence(CEX2018-000794-S)의 “Agencia Estatal de Investigación”의 지원을 받았습니다. Juliette Bedrossiantz는 스페인 정부와 유럽 사회 기금(ESF)이 공동 자금을 지원하는 박사 학위 보조금(PRE2018-083513)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
Referências
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