Den foreløbige undersøgelse bekræfter, at subaraknoid blødning (SAH) forårsager hjernepericytdød. Evaluering af pericytkontraktilitet efter SAH kræver differentiering mellem levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter. Derfor er der udviklet en procedure til at mærke levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter samtidigt i hjernesektioner, hvilket letter observation ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj opløsning.
Pericytter er afgørende vægmalerier beliggende i cerebral mikrocirkulation, afgørende for aktivt modulerende cerebral blodgennemstrømning via kontraktilitetsjusteringer. Konventionelt måles deres kontraktilitet ved at observere morfologiske skift og nærliggende kapillærdiameterændringer under specifikke omstændigheder. Alligevel bliver postvævsfiksering, evaluering af vitalitet og efterfølgende pericytkontraktilitet af afbildede hjernepericytter kompromitteret. På samme måde er genetisk mærkning af hjernepericytter kort i at skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericytter, især i neurologiske tilstande som subaraknoid blødning (SAH), hvor vores foreløbige undersøgelse validerer hjernens pericytdød. En pålidelig protokol er blevet udtænkt for at overvinde disse begrænsninger, hvilket muliggør samtidig fluorescerende mærkning af både funktionelle og ikke-funktionelle hjernepericytter i hjernesektioner. Denne mærkningsmetode tillader højopløsnings konfokal mikroskopvisualisering, samtidig med at hjerneskivens mikrovaskulatur markeres. Denne innovative protokol giver et middel til at vurdere hjernens pericytkontraktilitet, dens indvirkning på kapillærdiameter og pericytstruktur. Undersøgelse af hjernens pericytkontraktilitet inden for SAH-konteksten giver indsigtsfuld forståelse af dens virkninger på cerebral mikrocirkulation.
Hjernepericytter, kendetegnet ved deres slanke fremspring og fremspringende cellelegemer, omkranser mikrocirkulationen 1,2. Mens cerebral blodgennemstrømningsforøgelse overvejende drives af kapillær udvidelse, udviser mindre arterier langsommere dilatationshastigheder3. Pericytkontraktilitet udøver indflydelse på kapillærdiameter og pericytmorfologi, hvilket påvirker vaskulær dynamik4. Sammentrækning af hjernepericytter fører til kapillær indsnævring, og i patologiske scenarier kan overdreven sammentrækning hæmme erytrocytstrømmen5. Forskellige faktorer, herunder noradrenalin frigivet fra locus coeruleus, kan fremkalde hjernepericytkontraktion inden for kapillærer6. Med en regulerende rolle i cerebral blodgennemstrømning udviser pericytter 20-HETE-syntese, der tjener som en iltføler under hyperoxia7. Oxidativ-nitrativ stress-udløst sammentrækning af hjernens pericytter påvirker kapillærerne negativt5. På trods af både in vivo- og ex vivo-undersøgelser af hjernens pericytkontraktion 8 er der fortsat begrænset viden om billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver.
Det er afgørende, at billeddannelse efter vævsfiksering af hjernens pericytter kompromitterer deres vitalitet og efterfølgende kontraktilitetsvurdering. Desuden kan transgen mærkning af hjernepericytter i scenarier som neurologiske lidelser (f.eks. Subaraknoid blødning – SAH) ikke skelne mellem levedygtige og ikke-levedygtige pericyter, som bekræftet af vores foreløbige SAH-inducerede hjernepericytdødsundersøgelse9.
For at overvinde disse udfordringer anvendte vi TO-PRO-3 til at mærke levende pericytter, mens afdøde blev farvet med propidiumiodid (PI). Vi brugte konfokale billeddannelsesteknologier med høj opløsning til at visualisere levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, samtidig med at skiveaktiviteten bevares under billeddannelsen. Denne artikel har til formål at præsentere en reproducerbar metode til billeddannelse af levedygtige og ikke-levedygtige hjernepericytter i hjerneskiver, der tjener som et værdifuldt værktøj til at undersøge virkningen af hjernepericytter på cerebral mikrocirkulation efter SAH.
Udviklet er højopløselige konfokale billeddannelsesteknikker til visualisering af vitale hjernepericytter, ikke-vitale hjernepericytter og mikrovaskulaturen i hjerneskiver. I akutte rottehjerneskiver indebærer processen indledende mærkning af pericytter med TO-PRO-311 efterfulgt af mikrovaskulære endotelceller med IB412; efterfølgende udføres identifikation af afdøde pericytter ved hjælp af PI. Denne protokol er ligetil, reproducerbar og yderst anvendelig til funkt…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Naturvidenskabsfonden i Yunnan-provinsen (202001AS070045,202301AY070001-011)
6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |