एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव
Summary
यहां, हम एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए 5 दिनों के बाद निषेचन में जेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ जीवन के लिए आवश्यक कार्यों की एक श्रृंखला करता है। इसके विकास को प्रभावित करने वाले जन्मजात दोष एंटरिक न्यूरोमस्कुलर विकारों को जन्म दे सकते हैं, जीआई विकास और शिथिलता के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के महत्व पर प्रकाश डालते हैं। इस अध्ययन में, हम जीवित, व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए निषेचन के 5 दिनों के बाद जेब्राफिश लार्वा से आंत अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफिश आंत के मैनुअल विच्छेदन पर आधारित है, इसके बाद पपैन के साथ एंजाइमेटिक पृथक्करण होता है। इसके बाद, कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए प्रस्तुत किया जाता है, और व्यवहार्य कोशिकाओं को स्आरएनए-सीक्यू के लिए एकत्र किया जाता है। इस पद्धति के साथ, हम उपकला, स्ट्रोमल, रक्त, मांसपेशी, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, साथ ही एंटरिक न्यूरॉन्स और ग्लिया सहित विभिन्न आंतों के सेल प्रकारों की सफलतापूर्वक पहचान करने में सक्षम थे। इसलिए, हम इसे ज़ेब्राफिश का उपयोग करके स्वास्थ्य और बीमारी में जीआई पथ की संरचना का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन मानते हैं।
Introduction
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ एक जटिल प्रणाली है जो समग्र स्वास्थ्य और कल्याण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यह पाचन और पोषक तत्वों के अवशोषण, साथ ही अपशिष्ट उत्पादों 1,2 के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार है. जीआई पथ उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और एंटरिक तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) सहित कई सेल प्रकारों से बना है, जो उचित आंतों के कार्य 3,4,5को विनियमित करने और बनाए रखने के लिए एक साथ निकटता से संवाद करते हैं। जीआई पथ के विकास में दोष पोषक तत्व अवशोषण, माइक्रोबायोटा संरचना, आंत-मस्तिष्क अक्ष, और ईएनएस जैसे विभिन्न पहलुओं पर दूरगामी प्रभाव डाल सकते हैं, जिससे कई एंटरिक न्यूरोमस्कुलर विकार हो सकते हैं, जैसे कि हिर्स्चस्प्रंग रोग और क्रोनिक आंतों के छद्म रुकावट 6,7। इन विकारों को विभिन्न प्रमुख कोशिकाओं में परिवर्तन के कारण गंभीर आंत डिस्मोटिलिटी की विशेषता है, जैसे कि काजल की अंतरालीय कोशिकाएं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं और ईएनएस 6,8,9। हालांकि, जीआई विकास और शिथिलता के अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी खराब समझे जाते हैं।
ज़ेब्राफिश अपने तेजी से भ्रूण के विकास, भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान पारदर्शिता, और आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी 10,11,12,13,14के कारण जीआई विकास और शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कई ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनें उपलब्ध हैं। ऐसी रेखा का एक उदाहरण tg (phox2bb: GFP) जेब्राफिश है, जिसका उपयोग आमतौर पर ENS का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, क्योंकि एंटरिक न्यूरॉन्स सहित सभी phox2bb+ कोशिकाओं को15,16 लेबल किया जाता है। यहां, टीजी (फॉक्स 2 बीबी: जीएफपी) जेब्राफिश लाइन का उपयोग करते हुए, हम एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (स्आरएनए-सीक्यू) विश्लेषण(चित्रा 1) के लिए 5 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) लार्वा के आंतों के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एफएसीएस का उपयोग करके 5 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा के आंत के अलगाव और पृथक्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस पद्धति के साथ, 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म का उपयोग करके स्आरएनए-सीक्यू द्व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सोफिया फाउंडेशन (SSWO WAR-63) के दोस्तों द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
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