Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Summary

Qui, descriviamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula.

Abstract

Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l’importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell’intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.

Introduction

Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell’assorbimento dei nutrienti, nonché dell’eliminazione dei prodotti di scarto ^1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale ^3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l’assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l’asse intestino-cervello e l’ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica ^6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l’ENS ^6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.

Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l’ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate^15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).

Protocol

Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell’Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L’uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un’approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi. 1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP) Avvi…

Representative Results

Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l’isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fo…

Discussion

Qui, presentiamo un metodo per l’isolamento e la dissociazione dell’intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un’indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che…

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154