Tarmisolasjon fra sebrafisklarver for enkeltcelle RNA-sekvensering

Summary

Her beskriver vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning, for encellet RNA-sekvenseringsanalyse.

Abstract

Den gastrointestinale (GI) -kanalen utfører en rekke funksjoner som er avgjørende for livet. Medfødte defekter som påvirker utviklingen kan føre til enteriske nevromuskulære lidelser, og fremhever viktigheten av å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon. I denne studien presenterer vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning for å oppnå levende, levedyktige celler som kan brukes til encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse. Denne protokollen er basert på manuell disseksjon av sebrafisktarmen, etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon med papain. Deretter blir celler sendt til fluorescensaktivert cellesortering, og levedyktige celler samles for scRNA-seq. Med denne metoden var vi i stand til å identifisere forskjellige tarmcelletyper, inkludert epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller, samt enteriske nevroner og glia. Derfor anser vi det for å være en verdifull ressurs for å studere sammensetningen av GI-kanalen i helse og sykdom, ved hjelp av sebrafisken.

Introduction

Mage-tarmkanalen (GI) er et komplekst system som spiller en viktig rolle i generell helse og velvære. Det er ansvarlig for fordøyelsen og absorpsjonen av næringsstoffer, samt eliminering av avfallsprodukter ^1,2. GI-kanalen består av flere celletyper, inkludert epitelceller, glatte muskelceller, immunceller og det enteriske nervesystemet (ENS), som kommuniserer tett sammen for å regulere og opprettholde riktig tarmfunksjon ^3,4,5. Defekter i utviklingen av GI-kanalen kan ha vidtgående effekter på ulike aspekter som næringsopptak, mikrobiotasammensetning, tarm-hjerneaksen og ENS, noe som fører til flere enteriske nevromuskulære lidelser, som Hirschsprung sykdom og Kronisk intestinal pseudoobstruksjon ^6,7. Disse lidelsene kjennetegnes av alvorlig tarmdysmotilitet forårsaket av endringer i forskjellige nøkkelceller, som interstitielle celler i Cajal, glatte muskelceller og ENS ^6,8,9. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon fortsatt dårlig forstått.

Sebrafisken er en verdifull modellorganisme for å studere GI-utvikling og dysfunksjon på grunn av sin raske embryonale utvikling, gjennomsiktighet under embryonale stadier og larvestadier og genetisk trekkbarhet 10,11,12,13,14. Tallrike transgene sebrafisklinjer som uttrykker fluorescerende proteiner er tilgjengelige. Et eksempel på en slik linje er tg (phox2bb: GFP) sebrafisk, som vanligvis brukes til å studere ENS, da alle phox2bb + -celler, inkludert enteriske nevroner, er merket^15,16. Her presenterer vi ved hjelp av tg(phox2bb:GFP) sebrafisklinjen en metode for tarmisolering på 5 dager etter befruktning (dpf) larver for encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse (figur 1).

Protocol

Alt sebrafiskhold og forsøk ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjene i Erasmus MC og dyrevelferdslovgivningen. Bruk av sebrafisklarver 5 dager etter befruktning faller inn under kategorien forsøk som ikke krever formell etisk godkjenning, som beskrevet i nederlandsk regelverk. 1. Oppnå 5 dager etter befruktning (dpf) villtype og tg (phox2bb: GFP) larver Sett opp avl av villtype sebrafisk og samle 50 egg i HEPES-bufret E3 medium (herett…

Representative Results

Med denne protokollen oppnådde vi vellykket isolering og dissosiasjon av hele tarmen fra 5 dpf larver. Ved å bruke papain som dissosiasjonsenzym, forbedret vi signifikant cellens levedyktighet, noe som muliggjorde fangst av 46 139 hendelser som involverte enkle, levedyktige celler (6, 4% av alle celler) ut av 244 isolerte tarmer (figur 2A). Wildtype hele larver ble brukt som en kontroll for å sikre at sorteringsprosessen ble optimalisert, noe som muliggjorde effektiv celleidentifikasjon o…

Discussion

Her presenterer vi en metode for isolering og dissosiasjon av tarmen hos 5 dpf sebrafisklarver ved bruk av FACS. Med denne metoden ble forskjellige tarmcelletyper vellykket samlet og analysert av scRNA-seq, ved hjelp av 10x Genomics Chromium-plattformen. Vi valgte tg(phox2bb:GFP)-sebrafisklinjen, da vi ønsket en indikasjon på at levedyktige ENS-celler også ville være isolerte (figur 2D). Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden lett kan utvides til andre sebrafiskl…

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154