Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula
Summary
Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.
Abstract
El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.
Introduction
El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho 1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada 3,4,5. Los defectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal pueden tener efectos de gran alcance en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la composición de la microbiota, el eje intestino-cerebro y el SNE, lo que conduce a varios trastornos neuromusculares entéricos, como la enfermedad de Hirschsprung y la pseudoobstrucción intestinal crónica 6,7. Estos trastornos se caracterizan por una dismotilidad intestinal severa causada por alteraciones en varias células clave, como las células intersticiales de Cajal, las células musculares lisas y el SNE 6,8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal aún no se conocen bien.
El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar el desarrollo y la disfunción gastrointestinal debido a su rápido desarrollo embrionario, transparencia durante las etapas embrionaria y larvaria, y trazabilidad genética 10,11,12,13,14. Se dispone de numerosas líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes. Un ejemplo de este tipo de línea es el pez cebra tg(phox2bb:GFP), comúnmente utilizado para estudiar el SNE, ya que todas las células phox2bb+, incluidas las neuronas entéricas, están marcadas como15,16. Aquí, utilizando la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas 5 días después de la fertilización (dpf) para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tene…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amigos de Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
Referências
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
