यहां, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर को दवाओं और पौधों के अर्क के साथ खिलाने और फल मक्खियों के मल जमा का विश्लेषण करके जठरांत्र संबंधी मार्ग पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। दवा-उपचारित मक्खियों को आगे के शोध के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
मानव गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए, जैव चिकित्सा वैज्ञानिकों ने मॉडल जीवों के उपयोग पर भरोसा किया है। हालांकि कई शोधकर्ताओं ने आंतों के कार्य का अध्ययन करने के लिए चूहों को एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया है, केवल कुछ रिपोर्टों ने ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (डी। चूहों की तुलना में, फल मक्खियों कई फायदे पेश करते हैं, जैसे कि एक छोटा जीवन चक्र, लागत प्रभावी और सरल रखरखाव, और कोई नैतिक मुद्दे नहीं। इसके अलावा, स्तनधारी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी, शरीर रचना विज्ञान, और सिग्नलिंग मार्ग डी. मेलानोगास्टर में अत्यधिक संरक्षित हैं। पौधे के अर्क का उपयोग पारंपरिक रूप से दस्त और कब्ज के इलाज के लिए किया जाता है। उदाहरण के लिए, Psidium guajava (P. guajava) उष्णकटिबंधीय में सबसे प्रसिद्ध antidiarrheal एजेंटों में से एक है। हालांकि, किसी भी अध्ययन ने डी. मेलानोगास्टर में एंटीडायरेहियल और रेचक दवाओं और पौधों के अर्क के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया है, और यह अज्ञात है कि समान प्रभाव (जैसे, एंटीडायरेहिल दवाओं के मामले में छोटे, अधिक केंद्रित, और कम प्रचुर मात्रा में फेकल जमा) स्तनधारियों की तुलना में फल मक्खियों में हो सकते हैं। इस अध्ययन में, पी. गुजावा द्वारा प्रेरित एक एंटीडायरेहियल प्रभाव एक डी मेलानोगास्टर तनाव में प्रदर्शित किया जाता है जो एक डायरिया फेनोटाइप प्रस्तुत करता है। मक्खियों द्वारा उत्पादित फेकल नमूने की निगरानी डाई-पूरक भोजन का उपयोग करके की जाती है। यह प्रोटोकॉल दवाओं के साथ भोजन तैयार करने, इन खाद्य तैयारियों पर खिलाए गए मक्खियों के मल जमा का मूल्यांकन करने और प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि की रूपरेखा तैयार करता है।
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ, जिसे पाचन तंत्र भी कहा जाता है, पोषक तत्वों के पाचन और अवशोषण और अपचितउत्पादों के उत्सर्जन के लिए जिम्मेदार है। जीआई पथ विकारों की एक श्रृंखला के प्रति संवेदनशील है जो दैनिक जीवन में असुविधा, दर्द और व्यवधान पैदा कर सकता है। गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों में पेट दर्द और बेचैनी, सूजन, नाराज़गी, अपच या अपच, मतली, उल्टी, दस्त और कब्जशामिल हैं 2. डायरिया जीआई विकार3 का सबसे आम लक्षण है, और इसे 24 घंटे की अवधि4 के दौरान कम से कम तीन ढीले और पानी के मल के साथ एक बीमारी के रूप में परिभाषित किया गया है। दस्त रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होता है, बैक्टीरिया, वायरस, परजीवी, कवक सहित, और यह भी दवाओं 5,6 के कारण हो सकता है. दुनिया भर में, डायरिया5 साल से कम उम्र के बच्चों में मृत्यु दर का दूसरा प्रमुख कारण बना हुआ है। हालांकि दस्त खुद को हल कर सकता है, यह अधिक गंभीर अंतर्निहित स्थिति का संकेत भी दे सकता है यदि यह कुछ दिनों से अधिक समय तक रहता है।
आंत्र पथ का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ऐसे चूहों, चूहों, और सूअरों 8,9 के रूप में पशु मॉडल के लिए बारी. हालांकि, इन जानवरों का उपयोग महंगा और समय लेने वाला हो सकता है क्योंकि उन्हें विशेष सुविधाओं और नैतिक विचारों की आवश्यकता होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि डी. मेलानोगास्टर जीआई पथ का अध्ययन करने और पुनर्योजी होमियोस्टेसिस के रखरखाव जैसे कुछ तंत्रों की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिरक्षा जीर्णता का विकास, उपकला बाधा समारोह का नुकसान, और चयापचय होमियोस्टेसिस10,11में गिरावट. मेलानोगास्टर, जिसे फल मक्खी के रूप में जाना जाता है, मनुष्यों के साथ आनुवंशिक होमोलॉजी का एक उच्च स्तर साझा करता है; माना जाता है कि लगभग 75% मानव रोग जीन में एक कार्यात्मक होमोलॉग होता है मक्खी12. उनके पास एक सरल पाचन तंत्र भी होता है जिसमें एक फोरगट, एक मिडगट और एक हिंदगट13 होता है। मेलानोगास्टर प्रयोगशाला में संस्कृति के लिए आसान है और आनुवंशिक रूप से विभिन्न तरीकों से संशोधित किया जा सकता है14. इसलिए, विवो परीक्षण में के लिए डी. मेलानोगास्टर का उपयोग करना एक शक्तिशाली उपकरण है जो शोधकर्ताओं को नियंत्रित सेटिंग में जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, विकासशील देशों में रहने वाले लगभग 80% लोग अपनी प्राथमिकस्वास्थ्य आवश्यकताओं के लिए पारंपरिक चिकित्सा का उपयोग करते हैं। औषधीय पौधों के उच्च उपयोग तथ्य यह है कि वे आसानी से उपलब्ध हैं, सस्ती है, और कुछ साइड इफेक्ट16 द्वारा समझाया जा सकता है. हर्बल थेरेपी में उपयोग किए जाने वाले मुख्य पौधों के हिस्सों में पत्ते, छाल, जड़ें, बीज17 शामिल हैं, जबकि तैयारी के मुख्य तरीके जलसेक, काढ़ा और मैक्रेशन18 हैं। इन हर्बल उपचार ऐसे उपक्षारों के रूप में phytochemical पदार्थ शामिल, terpenoids, flavonoids, स्टेरॉयड, टैनिन और कार्बोहाइड्रेट19, जो मानव शरीर पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है. लोग जीआई विकारों जैसे दस्त, पेट दर्द और पेचिशके इलाज के लिए विभिन्न प्रकार के औषधीय पौधों का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, Psidium guajava दुनिया में दस्त के इलाज के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले पौधों में से एक है। विभिन्न औषधीय और नैदानिक परीक्षणों ने पहले ही अपनी सुरक्षा दिखाई है, जो इसे21,22 का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा एंटीडायरेहिल उम्मीदवार बनाते हैं। हालांकि, हर्बल दवाओं की प्रमुख सीमाओं दक्षता और सुरक्षा मूल्यांकन की कमी है, साथ ही23 इस्तेमाल संयंत्र के अर्क की संरचना के बारे में निश्चित और पूरी जानकारी की कमी के रूप में अच्छी तरह से. हर्बल दवाओं की दक्षता और सुरक्षा को मान्य करने के लिए, प्रयोगात्मक और नैदानिक सत्यापन से जुड़े एक व्यवस्थित दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है और दृष्टिकोण को इन विवो और इन विट्रो अध्ययनों से पर्याप्त डेटा द्वारा समर्थित किया जाना चाहिए।
दस्त के उपचार में उनकी प्रभावकारिता के लिए पारंपरिक उपचार का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों और चूहों का उपयोग हाल के दशकों24,25 में प्रमुख रहा है. पहले वर्णित मुख्य लाभों के कारण, यानी, मक्खियों और स्तनधारियों के बीच उपयोग में आसानी, सस्ती, प्रतिकृति, संरक्षित अवशोषक और पाचन कार्य, हम पौधों की एंटीडायरेहियल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में डी. मेलानोगास्टर का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं। डी. मेलानोगास्टर में डायरेरिक फेनोटाइप को कई विशेषताओं की विशेषता हो सकती है, जिसमें फेकल जमा की बहुतायत में वृद्धि, बड़े जमा आकार, एक हल्का रंग (कम केंद्रित), और उच्च फेकल सामग्री26शामिल है। इस फेनोटाइप को विभिन्न मापदंडों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है: फेकल जमा की संख्या, जमा का कुल क्षेत्रफल, मतलब हल्कापन, और कुल एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी)। कुल आईओडी को जमा की कुल डाई सामग्री के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसका अर्थ है कुल फेकल सामग्री27 उत्सर्जित होती है। पहले, एक परख डी के fecal जमा का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है मेलानोगास्टर27,28. इस परख में, गोबर (T.U.R.D.) के अंतिम पाठक का उपयोग एक फेकल विश्लेषण उपकरण के रूप में किया गया था, जो फेकल जमा की संख्या, आकार और हल्केपन की जांच करने की अनुमति देता है और इस प्रकार फल मक्खियों के आंतों के शरीर विज्ञान की निगरानी करता है। हालांकि, मक्खियों में डायरेरिक फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए इस विधि को कभी लागू नहीं किया गया था। आयन ट्रांसपोर्ट पेप्टाइड (आईटीपी) जीन प्यास और उत्सर्जन का एक महत्वपूर्ण अंतःस्रावी नियामक है और डी. मेलानोगास्टर में भोजन के साथ पानी के होमियोस्टेसिस को जोड़ता है। हाल के एक अध्ययन में, यह दिखाया गया था कि जीआई पथ में खाद्य पारगमन की गति और शौच की घटनाओं की आवृत्ति आईटीपी अति-अभिव्यक्ति से कम हो गई और आईटीपी नॉकडाउन द्वारा बढ़ गई। उत्तरार्द्ध फेनोटाइप को इस अध्ययन29 के लेखकों द्वारा डायरिक के रूप में वर्णित किया गया था।
इस प्रोटोकॉल में, फेकल जमा परख का एक संशोधित संस्करण एक डायरेहियल मॉडल के रूप में ITPi तनाव का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर के जठरांत्र संबंधी मार्ग पर एक antidiarrheal एजेंट (यानी, अमरूद पत्ती निकालने) के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियोजित किया जाता है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य है: 1) दवाओं और पौधों के अर्क के एंटीडायरेहियल प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय तरीका प्रदान करना, और 2) बायोएक्टिविटी-निर्देशित दृष्टिकोण लागू करके पौधे के अर्क में एंटीडायरेहिल प्रभाव के लिए जिम्मेदार बायोएक्टिव यौगिकों की खोज की अनुमति देना।
डी. मेलानोगास्टर को व्यापक रूप से विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल के रूप में स्वीकार किया गया है क्योंकि डी. मेलानोगास्टर और मनुष्यों के बीच जीन में समानता के कारण36. आंत्र पथ का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में डी. मेलानोगास्टर का उपयोग प्रचलित है और टीयूआरडी के आवेदन का उपयोग फेकल जमा की संख्या, क्षेत्र और मात्रा का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, फल मक्खियों में दस्त का आकलन करने के लिए फेनोटाइपिक डिटेक्शन विधि का उपयोग नहीं किया गया है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल फेकल जमा का पता लगाकर दस्त की उपस्थिति का मोटे तौर पर आकलन करने के लिए एक नई विधि का परिचय देता है।
फेकल जमा आंत्र पथ समारोह और स्वास्थ्य37 का एक आवश्यक संकेतक हैं. इस संदर्भ में, फेकल जमा के विभिन्न मापदंडों की जांच करने के लिए दवा-निहित माध्यम पर डी. मेलानोगास्टर को पालने के लिए एक विधि प्रस्तावित है। जमा की संख्या की निगरानी करके, शौच की आवृत्ति निर्धारित करना और यह आकलन करना संभव है कि किसी दवा का आंतों के संक्रमण पर कोई प्रभाव पड़ता है या नहीं। जमा के कुल क्षेत्र को फेकल पदार्थ की एकाग्रता और कमजोर पड़ने का मूल्यांकन करने के लिए मापा जा सकता है, जो आंत्र पथ के समग्र स्वास्थ्य को निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, कुल एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी) का उपयोग जमा में मौजूद फेकल सामग्री की कुल मात्रा का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल दवाओं के साथ-साथ आंतों के मार्ग को प्रभावित करने वाले पौधों के अर्क की जांच और मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करता है। जब डी. मेलानोगास्टर का उपयोग एक मॉडल जीव के रूप में किया जाता है, तो संभावित दवाओं की प्रभावकारिता का आकलन करना संभव है, जो दवा की खोज प्रक्रिया में तेजी लाने में मदद कर सकता है। पौधों के अर्क पर इस पद्धति को लागू करके, शोधकर्ता एंटीडायरेहिल एजेंटों के रूप में उनके उपयोग को मान्य करने में मदद कर सकते हैं।
वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कर रहे हैं में fecal जमा का अध्ययन करने के लिए डी. मेलानोगास्टर. सबसे पहले, माध्यम में दवा की वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक द्रव्यमान की गणना करना आवश्यक है। इसके अलावा, दवा को माध्यम में जोड़ते समय अच्छी तैयारी की स्थिति सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि उच्च तापमान दवा को नीचा दिखा सकता है और इसकी शक्ति को प्रभावित कर सकता है। दूसरा, मादा मक्खियों का चयन इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है. कुंवारी और संभोग मादाओं के बीच फेकल उत्पादन में अंतर से बचने के लिए कुंवारी मादा मक्खियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, कुंवारी महिलाओं द्वारा उत्पादित धब्बे संभोग मादाओं की तुलना में अधिक गोलाकार होते हैं, और संभोग मादाएं कुंवारी महिलाओं की तुलना में अधिक फेकल सामग्री का उत्सर्जन करती हैं27,28. इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एकत्र महिलाओं कुंवारी हैं बाड़े के 8 घंटे से पहले मक्खियों को इकट्ठा करने की सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, परीक्षण की गई मक्खियों को मजबूत और स्वस्थ होना चाहिए, क्योंकि उनका स्वास्थ्य भोजन का सेवन और फेकल उत्पादन को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, पंखों के असामान्य आकार वाली मक्खियों को भोजन प्राप्त करने में कठिनाई हो सकती है। अंत में, T.U.R.D. का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए, ब्लॉक आकार (पिक्सेल) और ऑफ़सेट सेटिंग्स महत्वपूर्ण हैं। छवियों के प्रकाश विपरीत में अंतर के कारण, फेकल जमा की सर्वोत्तम संभव पहचान प्राप्त करने के लिए विभिन्न सेटिंग्स का प्रयास करना आवश्यक हो सकता है।
यद्यपि प्रस्तुत विधि प्रभावी है, कई सीमाएँ हैं। एक माध्यम में दवा एकाग्रता की सटीकता है। चूंकि तैयारी के दौरान माध्यम को गर्म किया जाता है, कुछ पानी वाष्पित हो सकता है, जो दवा की एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है। एक और सीमा पेट्री व्यंजन की स्कैनिंग है. पेट्री व्यंजन (यानी, किनारों) के कुछ हिस्सों को स्कैन नहीं किया जाता है, और इसके परिणामस्वरूप कुल फेकल जमा का गलत अनुमान हो सकता है। इसके अलावा, मक्खियों पेट्री व्यंजन के ऊपर और नीचे कवर पर fecal जमा की एक ही राशि का उत्पादन नहीं करते. क्योंकि वे नीचे के कवर पर अधिक जमा का उत्पादन करते हैं, ऊपर और नीचे के कवर के बीच विश्लेषण का मानक विचलन अधिक हो सकता है, जो परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं में दस्त का अध्ययन कर सकते हैं डी. मेलानोगास्टर. दवा युक्त माध्यम को संशोधित करके, इस विधि का उपयोग एंटीडायरेहिल पौधों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, जो दवा की खोज के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों सहित विभिन्न बीमारियों के इलाज के लिए सदियों से पारंपरिक चिकित्सा और प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग किया जाता रहा है। फेकल जमा पर पौधे के अर्क की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आंतों के पथ के विकारों के लिए संभावित नए उपचार की पहचान की जा सकती है और एंटीडायरेहिल एजेंटों के रूप में उनके उपयोग के लिए एक वैज्ञानिक तर्क प्रदान किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण दवा की खोज और नृवंशविज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण योगदान प्रदान कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम ड्रोसोफिला उपभेदों के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ मार्टिना गैलिकोवा धन्यवाद. हम अपने अध्ययन पर प्रतिक्रिया देने और हमारे मॉडल को बेहतर बनाने में हमारी मदद करने के लिए मिशेल क्रोज़ेटियर-बोर्डे और मार्क हेनलिन टीम के आभारी हैं। हम दवा क्रोफेलेमर प्रदान करने के लिए नापो फार्मास्यूटिकल्स कंपनी को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित करने का अवसर प्रदान करने के लिए अतिथि संपादक डॉ ह्यूजेस पेटिटजेन के भी आभारी हैं। इस अध्ययन को परियोजना ANR-22-CE03-0001-01 के तहत एजेंस नेशनेल डे ला रिचर्चे (ANR) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |