Trabekulær knoglemikroarkitektur evaluering i en osteoporose mus model
Summary
Denne protokol præsenterer en økonomisk og effektiv metode til kvantitativ evaluering af knoglemikroarkitektur i en musemodel af osteoporose ved at kombinere Hematoxylin-Eosin (HE) farvning og mikrocomputertomografi (Micro-CT) teknikker.
Abstract
Knoglemikrostruktur refererer til arrangementet og kvaliteten af knoglevæv på mikroskopisk niveau. Forståelse af knoglemikrostrukturen i skelettet er afgørende for at få indsigt i osteoporoseens patofysiologi og forbedre behandlingen. Håndtering af knogleprøver kan dog være kompleks på grund af deres hårde og tætte egenskaber. For det andet gør specialiseret software billedbehandling og analyse vanskelig. I denne protokol præsenterer vi en omkostningseffektiv og brugervenlig løsning til trabekulær knoglemikrostrukturanalyse. Detaljerede trin og forholdsregler er angivet. Micro-CT er en ikke-destruktiv tredimensionel (3D) billeddannelsesteknik, der giver billeder i høj opløsning af trabekulær knoglestruktur. Det giver mulighed for objektiv og kvantitativ evaluering af knoglekvalitet, hvorfor det bredt betragtes som guldstandardmetoden til vurdering af knoglekvalitet. Imidlertid forbliver histomorfometri uundværlig, da den tilbyder afgørende parametre på celleniveau, der bygger bro mellem todimensionelle (2D) og 3D-vurderinger af knogleprøver. Hvad angår de histologiske teknikker, valgte vi at afkalke knoglevævet og derefter udføre traditionel paraffinindlejring. Sammenfattende kan kombinationen af disse to metoder give mere omfattende og præcise oplysninger om knoglemikrostruktur.
Introduction
Osteoporose er en udbredt metabolisk knoglesygdom, især blandt ældre, og er forbundet med en øget risiko for skrøbelighedsfrakturer. Da osteoporose bliver mere almindelig i Kina1, vil der være en stigende efterspørgsel efter at studere knoglestrukturerne hos små dyr 2,3. De tidligere metoder til måling af knogletab er afhængige af resultaterne af todimensionel røntgenabsorptiometri med dobbelt energi. Dette fanger imidlertid ikke ændringerne i den arkitektoniske mikrostruktur af den trabekulære knogle, hvilket er en nøglefaktor for skeletstyrke4. Mikrostrukturen af knogle påvirker dens styrke, stivhed og brudmodstand. Ved at sammenligne knoglemikroarkitektur i normale og patologiske tilstande kan ændringer i knoglevævsmorfologi, struktur og funktion forårsaget af osteoporose identificeres. Disse oplysninger bidrager til forståelsen af udviklingen af osteoporose og dens tilknytning til andre sygdomme.
Mikrocomputertomografi (Micro-CT) billeddannelse er for nylig blevet en populær teknik til knoglemorfologivurdering, hvor den kan give nøjagtige og omfattende data om knoglestruktur og densitetsparametre såsom knoglevolumenfraktion, tykkelse og adskillelse 5,6. Samtidig kan Micro-CT-resultaterne påvirkes af analysesoftwaren7. Forskellige metoder til billedindsamling, evaluering og rapportering anvendes af forskellige kommercielle Micro-CT-systemer. Denne inkonsekvens gør det vanskeligt at sammenligne og fortolke de resultater, der rapporteres af forskellige undersøgelser5. Det kan heller ikke i øjeblikket erstatte knoglehistomorfometri ved at give forskere information om parametre på celleniveau i skeletsystemet8. I mellemtiden tillader histologiske teknikker direkte observation og måling af knoglens mikroskopiske morfologi. Hæmatoxylin og eosin (HE) farvning er en almindelig farvningsteknik, der anvendes i histologi til at visualisere den generelle struktur af celler og væv. Det bruges til at identificere tilstedeværelsen af knoglevæv og dets mikroarkitektur.
Denne artikel bruger Micro-CT kombineret med vævsskæringsteknik (Hematoxylin-Eosin [HE] farvning) til at indsamle knoglevævsbilleder og udføre kvantitativ analyse af trabekulær knogle for at evaluere ændringerne i knoglemikrostruktur i en osteoporose musemodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose kan føre til hyppige brud, som er dyre, kan forårsage smerte, handicap eller endda død og alvorligt påvirke patienternes livskvalitet20. I årenes løb er ovariektomimodellen blevet anerkendt som en af standardmetoderne til undersøgelse af osteoporose21. Den mest almindelige prækliniske dyremodel for osteoporose er ovariectomized (OVX) rotte. På trods af dette er størstedelen af forskningen i mekanismerne for knoglelidelser, herunder osteoporose, blevet …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) og Graduate Research Innovation Project fra School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referências
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
