הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).
Abstract
מיקרו-מבנה עצם מתייחס לסידור ואיכות רקמת העצם ברמה המיקרוסקופית. הבנת מיקרו-מבנה העצם של השלד חיונית להשגת תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה של אוסטאופורוזיס ושיפור הטיפול בה. עם זאת, טיפול בדגימות עצם יכול להיות מורכב בשל תכונותיהן הקשות והצפופות. שנית, תוכנה מיוחדת מקשה על עיבוד וניתוח תמונה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פתרון חסכוני וקל לשימוש לניתוח מיקרו-מבנה עצם טרבקולרית. צעדים מפורטים ואמצעי זהירות מסופקים. Micro-CT היא טכניקת הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) לא הרסנית המספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנה העצם הטרבקולרית. היא מאפשרת הערכה אובייקטיבית וכמותית של איכות העצם, ולכן היא נחשבת לשיטת תקן הזהב להערכת איכות העצם. עם זאת, היסטומורפומטריה נותרה הכרחית מכיוון שהיא מציעה פרמטרים חיוניים ברמת התא, המגשרת על הפער בין הערכות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות של דגימות עצם. באשר לטכניקות ההיסטולוגיות, בחרנו להסיר את רקמת העצם ולאחר מכן לבצע הטבעה מסורתית של פרפין. לסיכום, שילוב של שתי שיטות אלה יכול לספק מידע מקיף ומדויק יותר על מיקרו-מבנה העצם.
Introduction
אוסטאופורוזיס היא מחלת עצם מטבולית נפוצה, במיוחד בקרב קשישים, והיא קשורה לסיכון מוגבר לשברים שבירים. ככל שאוסטאופורוזיס הופך נפוץ יותר בסין1, יהיה ביקוש גובר לחקר מבני העצם של בעלי חיים קטנים 2,3. השיטות הקודמות למדידת אובדן עצם מסתמכות על התוצאות של ספיגת קרני רנטגן דו-ממדית באנרגיה כפולה. עם זאת, זה לא לוכד את השינויים במיקרו-מבנה האדריכלי של עצם הטרבקולר, שהוא גורם מפתח לחוזק השלד4. המיקרו-מבנה של העצם משפיע על חוזקה, נוקשותה ועמידותה בפני שברים. על ידי השוואת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במצבים נורמליים ופתולוגיים, ניתן לזהות שינויים במורפולוגיה, במבנה ובתפקוד של רקמת העצם הנגרמים על ידי אוסטאופורוזיס. מידע זה תורם להבנת התפתחות אוסטאופורוזיס והקשר שלה למחלות אחרות.
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT) הפכה לאחרונה לטכניקה פופולרית להערכת מורפולוגיה של העצם, שם היא יכולה לספק נתונים מדויקים ומקיפים על מבנה העצם ופרמטרים של צפיפות כגון שבר נפח עצם, עובי והפרדה 5,6. יחד עם זאת, תוצאות Micro-CT יכולות להיות מושפעות מתוכנת הניתוח7. שיטות שונות של רכישה, הערכה ודיווח של תמונות משמשות מערכות מיקרו-CT מסחריות שונות. חוסר עקביות זה מקשה על השוואה ופירוש התוצאות המדווחות על ידי מחקרים שונים5. כמו כן, היא אינה יכולה כיום להחליף את ההיסטומורפומטריה של העצם במתן מידע לחוקרים על פרמטרים ברמה התאית במערכת השלד8. בינתיים, טכניקות היסטולוגיות מאפשרות תצפית ישירה ומדידה של המורפולוגיה המיקרוסקופית של העצם. צביעת Hematoxylin ו- eosin (HE) היא טכניקת צביעה נפוצה המשמשת בהיסטולוגיה כדי לדמיין את המבנה הכללי של תאים ורקמות. הוא משמש לזיהוי נוכחות של רקמת העצם ואת microarchitecture שלה.
מאמר זה משתמש במיקרו-CT בשילוב עם טכניקת חיתוך רקמות (צביעת Hematoxylin-Eosin [HE]) כדי לאסוף תמונות של רקמת עצם ולבצע ניתוח כמותי של עצם טרבקולרית כדי להעריך את השינויים במיקרו-מבנה העצם במודל עכבר אוסטאופורוזיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
אוסטאופורוזיס יכול להוביל לשברים תכופים, שהם יקרים, יכולים לגרום לכאב, נכות או אפילו מוות, ולהשפיע קשות על איכות החיים של חולים20. במהלך השנים הוכר מודל כריתת השחלות כאחת השיטות הסטנדרטיות לחקר אוסטאופורוזיס21. המודל הפרה-קליני הנפוץ ביותר בבעלי חיים לאוסטאופורוז?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המנהל המחוזי של סצ’ואן לרפואה סינית מסורתית (2021YJ0175) ופרויקט חדשנות המחקר לתארים מתקדמים של בית הספר לרפואה קלינית (LCYJSKT2023-11), אוניברסיטת צ’נגדו לרפואה סינית מסורתית.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referências
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
