בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר
Summary
לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.
Abstract
פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא סוג נפוץ של הפרעה שעלולה להיות ממאירה בחלל הפה. ניוון אפיתל ופיברוזיס של lamina propria ואת submucosa נמצאים לעתים קרובות על שקופיות היסטופתולוגיות. דיספלסיה אפיתליאלית, ניוון אפיתל ופיברובלסטים מזדקנים הוצעו כקשורים לשינוי ממאיר של OSF. עם זאת, בגלל ההטרוגניות של הפרעות אוראליות שעלולות להיות ממאירות וקרצינומה של תאי קשקש אוראליים, קשה לזהות את המנגנונים המולקולריים הספציפיים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF. כאן, אנו מציגים שיטה להשגת מספר קטן של תאים אפיתליאליים או מזנכימליים הנושאים נתונים מורפולוגיים ומידע מרחבי על ידי לכידת לייזר microdissection על שקופיות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין. באמצעות מיקרוסקופ, אנו יכולים ללכוד במדויק מיקרוסקאלה (~ 500 תאים) רקמת אפיתל דיספלסטית או אטרופית ורקמה תת-אפיתל פיברוטית. ניתן להעריך את התאים שחולצו על ידי ריצוף גנום או שעתוק כדי להשיג נתונים גנומיים ושעתוק עם מידע מורפולוגי ומרחבי. גישה זו מסירה את ההטרוגניות של ריצוף רקמות OSF בתפזורת ואת ההפרעה הנגרמת על ידי תאים באזורים שאינם נגועים, ומאפשרת ניתוח מרחבי מדויק של רקמת OSF.
Introduction
פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא מחלה כרונית וחתרנית המתפתחת בעיקר ברירית הבוקאלית וגורמת לפתיחת פה מוגבלת1. בעוד OSF היא מחלה multifactorial, אגוז ארקה או אגוז betel לעיסה היא הגורם העיקרי של OSF 2,3. בגלל הרגל גיאוגרפי ספציפי זה, OSF מרוכז בעיקר באוכלוסיות בדרום מזרח ודרום אסיה3. המאפיינים ההיסטולוגיים הנפוצים של OSF כוללים שקיעת קולגן חריגה ברקמת החיבור מתחת לאפיתל רירית הפה, היצרות כלי הדם וחסימה1. רקמת אפיתל OSF יכולה להציג עם ביטויים של ניוון או hyperplasia ואפילו דיספלסיה כאשר במקביל leukoplakia אוראלי 4,5.
OSF מוגדר על ידי ארגון הבריאות העולמי כהפרעה פומית פוטנציאלית ממאירה נפוצה (OPMD) המציגה את הפוטנציאל להתקדם לקרצינומה של תאי קשקש אוראליים עם שיעור טרנספורמציה ממאירה של 4%-6%6,7,8,9. המנגנון העומד בבסיס הטרנספורמציה הממאירה של OSF הוא מורכב10. גדילה חריגה של האפיתל, כולל דיספלזיה וניוון, מגבירה את הפוטנציאל לקרצינוגנזה, ופיברובלסטים מזדקנים בסטרומה עשויים להיות מעורבים בהתקדמות הממאירה של OSF על ידי גרימת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) דרך מיני חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות10.
טכנולוגיות לניתוחים מרחביים-אומיים הפיקו נתונים רב-אומיים עם מידע מורפולוגי ומרחבי שסיפקו תובנות לגבי מנגנוני סרטן11,12,13. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אוכלוסיות תאים הקשורות למורפולוגיה מרקמת OSF משובצת פרפין קבועה פורמלין על ידי מיקרודיסקציה בלייזר. ניתוחים רב-אומיים של דגימות אלה יכולים להתגבר על אתגרים עם הטרוגניות תוך רקמתית ולהגביר את ההבנה של הפתולוגיה המולקולרית והמנגנונים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF14.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה דיווח על צינור ללכידת דגימות רקמת OSF עם מידע מורפולוגי ומרחבי לניתוחים מרחביים-אומיים נוספים באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. מהתוצאות המייצגות, זיהינו דפוסי CNA שונים בקרב דגימות שונות הקשורות למורפולוגיה.
OSF, סוג של OPMD, הוא מצב טרום סרטני נפוץ של קרצינומה של תאי קשק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81671006, 81300894), קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-038), פרויקט הבנייה הלאומי של דיסציפלינה קלינית מרכזית (PKUSSNKP-202102), קרן חדשנות לדוקטורנטים מצטיינים של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת פקין (BMU2022BSS001).
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
Referências
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
