レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる口腔粘膜下線維症サンプルからの形態学的および空間的情報による細胞の分離
Summary
口腔粘膜下線維症組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、形態学的および空間的情報を含むマルチオミクスデータの解析のために、関心のある組織学的領域から細胞を正確に抽出することを可能にします。
Abstract
口腔粘膜下線維症(OSF)は、口腔内の悪性の可能性のある疾患の一般的なタイプです。上皮の萎縮および固有層および粘膜下層の線維症は、病理組織学的スライドにしばしば見られる。上皮異形成、上皮萎縮、および老化線維芽細胞は、OSFの悪性形質転換に関連していることが提案されています。しかし、潜在的に悪性の口腔疾患と口腔扁平上皮癌の不均一性のため、OSFにおける悪性形質転換の特定の分子機構を特定することは困難です。本研究では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織スライド上にレーザー捕捉マイクロダイセクションにより、形態学的データや空間情報を有する少数の上皮細胞または間葉系細胞を得る方法を紹介します。顕微鏡を用いることで、マイクロスケール(~500細胞)の異形成性または萎縮性上皮組織や線維性上皮下組織を正確に捕捉することができます。抽出された細胞は、ゲノムまたはトランスクリプトームシーケンシングによって評価され、形態学的および空間的情報を含むゲノムおよびトランスクリプトームデータを取得できます。このアプローチにより、バルクOSF組織シーケンシングの不均一性や、非病変領域の細胞によって引き起こされる干渉が除去され、OSF組織の正確な空間オミクス解析が可能になります。
Introduction
口腔粘膜下線維症(OSF)は、主に頬粘膜に発症し、口の開きが制限される慢性の潜行性疾患です1。OSFは多因子性疾患ですが、ビンロウの実やビンロウの咀嚼がOSF 2,3の主な原因です。この地理的に特異的な習性のため、OSFは主に東南アジアと南アジアの集団に集中しています3。OSFの一般的な組織学的特徴には、口腔粘膜上皮下の結合組織における異常なコラーゲン沈着、血管狭窄、および閉塞が含まれます1。OSF上皮組織は、口腔白板症を併発すると、萎縮または過形成、さらには異形成の症状を呈することがあります4,5。
OSFは、世界保健機関によって、悪性形質転換率が4%〜6%の口腔扁平上皮癌に進行する可能性のある一般的な口腔悪性疾患(OPMD)として定義されています6,7,8,9。OSFの悪性形質転換の根底にあるメカニズムは複雑である10。異形成と萎縮の両方を含む上皮の異常な増殖は発がんの可能性を高め、間質の老化線維芽細胞は、活性酸素種(ROS)やその他の分子を介して上皮間葉転換(EMT)を誘導することにより、OSFの悪性進行に関与している可能性があります10。
空間オミクス解析技術は、形態学的および空間的情報を含むマルチオミクスデータを生成し、がんのメカニズムに関する洞察を提供しました11,12,13。ここでは、レーザーマイクロダイセクションによってホルマリン固定パラフィン包埋OSF組織から形態関連細胞集団を捕捉するプロトコルを提示します。これらのサンプルのマルチオミクス解析は、組織内の不均一性に関する課題を克服し、OSF14における分子病理学と悪性形質転換のメカニズムの理解を深めることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、レーザーマイクロダイセクションによるさらなる空間オミクス分析のために、形態学的および空間的情報を含むOSF組織サンプルを捕捉するパイプラインを報告しました。代表的な結果から、形態に関連するさまざまなサンプル間で異なるCNAパターンを特定しました。
OPMDの一種であるOSFは、口腔扁平上皮がんの一般的な前がん状態です6。…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(81671006、81300894)、CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(2019-I2M-5-038)、National clinical key discipline construction project(PKUSSNKP-202102)、Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center(BMU2022BSS001)の研究助成金の支援を受けて行われました。
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
Referências
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
