Isolering av celler med morfologisk og romlig informasjon fra orale submukøse fibroseprøver ved laserfangstmikrodisseksjon

Summary

Laserfangstmikrodisseksjon av oralt submukøs fibrosevev muliggjør presis ekstraksjon av celler fra histologiske regioner av interesse for analyse av multi-omics data med morfologisk og romlig informasjon.

Abstract

Oral submukøs fibrose (OSF) er en vanlig type potensielt ondartet lidelse i munnhulen. Atrofi av epitel og fibrose av lamina propria og submukosa finnes ofte på histopatologiske lysbilder. Epitelial dysplasi, epitelial atrofi og senescent fibroblaster har blitt foreslått å være assosiert med ondartet transformasjon av OSF. På grunn av heterogeniteten til potensielt ondartede orale lidelser og oralt plateepitelkarsinom, er det imidlertid vanskelig å identifisere de spesifikke molekylære mekanismene for ondartet transformasjon i OSF. Her presenterer vi en metode for å oppnå et lite antall epitel- eller mesenkymale celler som bærer morfologiske data og romlig informasjon ved laserfangstmikrodisseksjon på formalinfikserte parafininnebygde vevslysbilder. Ved hjelp av et mikroskop kan vi nøyaktig fange mikroskala (~ 500 celler) dysplastisk eller atrofisk epitelvev og fibrotisk subepitelvev. De ekstraherte cellene kan evalueres ved genom- eller transkriptomsekvensering for å skaffe genomiske og transkriptomiske data med morfologisk og romlig informasjon. Denne tilnærmingen fjerner heterogeniteten til bulk OSF-vevssekvensering og interferensen forårsaket av celler i ikke-lesjonerte områder, noe som muliggjør presis romlig omics-analyse av OSF-vev.

Introduction

Oral submukøs fibrose (OSF) er en kronisk, lumsk sykdom som utvikler seg hovedsakelig i bukkalslimhinnen og resulterer i begrenset munnåpning¹. Mens OSF er en multifaktoriell sykdom, er areca-mutter eller betelnøtttygge hovedårsaken til OSF ^2,3. På grunn av denne geografisk spesifikke vanen er OSF hovedsakelig konsentrert i populasjoner i Sørøst- og Sør-Asia³. De vanlige histologiske egenskapene til OSF inkluderer unormal kollagenavsetning i bindevevet under munnslimhinneepitelet, vaskulær stenose og okklusjon¹. OSF-epitelvev kan presentere manifestasjoner av atrofi eller hyperplasi og til og med dysplasi når det er samtidig med oral leukoplaki ^4,5.

OSF er definert av Verdens helseorganisasjon som en vanlig oral potensielt ondartet lidelse (OPMD) som viser potensial til å utvikle seg til oralt plateepitelkarsinom med en ondartet transformasjonsrate på 4%-6%6,7,8,9. Mekanismen bak den ondartede transformasjonen av OSF er kompleks¹⁰. Unormal vekst av epitelet, inkludert både dysplasi og atrofi, øker potensialet for karsinogenese, og senescent fibroblaster i stroma kan være involvert i den ondartede progresjonen av OSF ved å indusere epithelial-mesenkymal overgang (EMT) gjennom reaktive oksygenarter (ROS) og andre molekyler¹⁰.

Teknologier for romlig-omiske analyser genererte multi-omiske data med morfologisk og romlig informasjon som har gitt innsikt i kreftmekanismer^11,12,13. Her presenterer vi en protokoll for å fange morfologirelaterte cellepopulasjoner fra formalinfiksert parafininnebygd OSF-vev ved lasermikrodisseksjon. Multi-omiske analyser av disse prøvene kan overvinne utfordringer med intravevsheterogenitet og øke forståelsen av molekylær patologi og mekanismer for ondartet transformasjon i OSF¹⁴.

Protocol

Denne studien ble godkjent av det institusjonelle gjennomgangsstyret ved Peking University School and Hospital. Det ble innhentet informert samtykke fra pasientene. Vevsprøvene som ble brukt i denne studien ble avidentifisert. Studieskjemaet er vist i figur 1. 1. Forberedelse av prøver Skjær formalinfiksert parafininnebygd oralt submukøs fibrosevev i kontinuerlige seksjoner på 3 μm og 10 μm tykkelse på en mikrotom. Bret…

Representative Results

Ved å utføre lasermikrodisseksjon av OSF-vev fanget vi prøver av dysplastisk epitel, stroma under dysplastisk epitel, atrofisk epitel og stroma under atrofisk epitelvev (figur 1). Gjennom ekstrahering av DNA og lavdybde helgenomsekvensering var vi i stand til å analysere morfologirelaterte kopinummerendringer (CNA) 15. CNA er en vanlig form for genomisk instabilitet assosiert med økt risiko for malign transformasjon i OPMD15,16<…

Discussion

Denne protokollen rapporterte en rørledning for å fange OSF-vevsprøver med morfologisk og romlig informasjon for videre romlig-omiske analyser gjennom lasermikrodisseksjon. Fra de representative resultatene identifiserte vi forskjellige CNA-mønstre blant ulike morfologirelaterte prøver.

OSF, en type OPMD, er en vanlig forstadier tilstand av oral plateepitelkarsinom⁶. Genomisk ustabilitet er rapportert å være assosiert med utvikling og ondartet transformasjon av O…

Materials

Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535