Aislamiento de Células con Información Morfológica y Espacial a partir de Muestras de Fibrosis Submucosa Oral mediante Microdisección por Captura Láser
Summary
La microdisección por captura láser de tejidos de fibrosis submucosa oral permite la extracción precisa de células de regiones histológicas de interés para el análisis de datos multiómicos con información morfológica y espacial.
Abstract
La fibrosis submucosa oral (FSO) es un tipo común de trastorno potencialmente maligno en la cavidad oral. La atrofia del epitelio y la fibrosis de la lámina propia y la submucosa se encuentran a menudo en los portaobjetos histopatológicos. Se ha propuesto que la displasia epitelial, la atrofia epitelial y los fibroblastos senescentes se asocian con la transformación maligna de la FSO. Sin embargo, debido a la heterogeneidad de los trastornos orales potencialmente malignos y del carcinoma oral de células escamosas, es difícil identificar los mecanismos moleculares específicos de la transformación maligna en la FSO. Aquí, presentamos un método para obtener un pequeño número de células epiteliales o mesenquimales portadoras de datos morfológicos e información espacial mediante microdisección por captura láser en portaobjetos de tejido fijados en formol e incluidos en parafina. Usando un microscopio, podemos capturar con precisión tejido epitelial displásico o atrófico a microescala (~500 células) y tejido subepitelial fibrótico. Las células extraídas pueden ser evaluadas mediante secuenciación genómica o transcriptómica para adquirir datos genómicos y transcriptómicos con información morfológica y espacial. Este enfoque elimina la heterogeneidad de la secuenciación de tejido OSF a granel y la interferencia causada por las células en áreas no lesionadas, lo que permite un análisis espacio-ómico preciso del tejido OSF.
Introduction
La fibrosis submucosa oral (FSO) es una enfermedad crónica e insidiosa que se desarrolla principalmente en la mucosa bucal y provoca una apertura bucal restringida1. Si bien la OSF es una enfermedad multifactorial, la masticación de la nuez de areca o la nuez de betel es la principal causa de la OSF 2,3. Debido a este hábito geográficamente específico, la PPO se concentra predominantemente en poblaciones del sudeste y sur de Asia3. Las características histológicas comunes de la OSF incluyen la deposición anormal de colágeno en el tejido conectivo debajo del epitelio de la mucosa oral, la estenosis vascular y la oclusión1. El tejido epitelial de la FSO puede presentar manifestaciones de atrofia o hiperplasia e incluso displasia cuando es concomitante con leucoplasia oral 4,5.
La Organización Mundial de la Salud define la OSF como un trastorno oral potencialmente maligno (OPMD, por sus siglas en inglés) común que exhibe el potencial de progresar a carcinoma oral de células escamosas con una tasa de transformación maligna del 4% al 6%6%6,7,8,9. El mecanismo que subyace a la transformación maligna de la FSO es complejo10. El crecimiento anormal del epitelio, incluyendo tanto la displasia como la atrofia, aumenta el potencial de carcinogénesis, y los fibroblastos senescentes en el estroma pueden estar involucrados en la progresión maligna de la OSF al inducir la transición epitelio-mesenquimal (EMT) a través de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas10.
Las tecnologías para el análisis espacio-ómico generaron datos multiómicos con información morfológica y espacial que han proporcionado información sobre los mecanismos del cáncer11,12,13. Aquí, presentamos un protocolo para capturar poblaciones celulares relacionadas con la morfología a partir de tejido OSF fijado en formol e incluido en parafina mediante microdisección láser. Los análisis multiómicos de estas muestras pueden superar los desafíos de la heterogeneidad intratisular y aumentar la comprensión de la patología molecular y los mecanismos de transformación maligna en OSF14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo reportó una tubería para capturar muestras de tejido OSF con información morfológica y espacial para posteriores análisis espaciales-ómicos a través de microdisección láser. A partir de los resultados representativos, se identificaron diferentes patrones de CNA entre varias muestras relacionadas con la morfología.
La OSF, un tipo de OPMD, es una afección precancerosa común del carcinoma oral de células escamosas6. Se ha descrito que la inesta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (81671006, 81300894), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-038), el Proyecto Nacional de Construcción de Disciplinas Clínicas Clave (PKUSSNKP-202102), el Fondo de Innovación para Candidatos Sobresalientes a Doctorado del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín (BMU2022BSS001).
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
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