Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu ile Oral Submukoz Fibrozis Örneklerinden Morfolojik ve Mekansal Bilgilerle Hücrelerin İzolasyonu
Summary
Oral submukoz fibroz dokularının lazer yakalama mikrodiseksiyonu, morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik verilerin analizi için ilgilenilen histolojik bölgelerden hücrelerin hassas bir şekilde çıkarılmasına izin verir.
Abstract
Oral submukoz fibrozis (OSF), ağız boşluğunda yaygın olarak görülen potansiyel olarak malign bir bozukluk türüdür. Epitel atrofisi ve lamina propria ve submukoza fibrozisi sıklıkla histopatolojik slaytlarda bulunur. Epitelyal displazi, epitelyal atrofi ve yaşlanan fibroblastların OSF’nin malign transformasyonu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür. Bununla birlikte, potansiyel olarak malign oral bozuklukların ve oral skuamöz hücreli karsinomun heterojenliği nedeniyle, OSF’de malign transformasyonun spesifik moleküler mekanizmalarını tanımlamak zordur. Burada, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku preparatları üzerinde lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile morfolojik veri ve uzamsal bilgi taşıyan az sayıda epitelyal veya mezenkimal hücre elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Mikroskop kullanarak, mikro ölçekli (~ 500 hücre) displastik veya atrofik epitel dokusunu ve fibrotik subepitel dokusunu hassas bir şekilde yakalayabiliriz. Ekstrakte edilen hücreler, morfolojik ve mekansal bilgilerle genomik ve transkriptomik veriler elde etmek için genom veya transkriptom dizilimi ile değerlendirilebilir. Bu yaklaşım, toplu OSF doku diziliminin heterojenliğini ve lezyonsuz alanlardaki hücrelerin neden olduğu girişimi ortadan kaldırarak, OSF dokusunun hassas uzamsal-omik analizine izin verir.
Introduction
Oral submükoz fibrozis (OSF), esas olarak bukkal mukozada gelişen ve ağız açıklığının kısıtlanması ile sonuçlanan kronik, sinsi bir hastalıktır1. OSF multifaktöriyel bir hastalık iken, areca fıstığı veya tembul fıstığı çiğneme OSF 2,3’ün ana nedenidir. Coğrafi olarak spesifik olan bu alışkanlık nedeniyle, OSF ağırlıklı olarak Güneydoğu ve Güney Asya’daki popülasyonlarda yoğunlaşmıştır3. OSF’nin yaygın histolojik özellikleri arasında oral mukozal epitelin altındaki bağ dokusunda anormal kollajen birikimi, vasküler stenoz ve oklüzyon1 yer alır. OSF epitel dokusu, oral lökoplaki ile birlikte olduğunda atrofi veya hiperplazi ve hatta displazi belirtileri ile ortaya çıkabilir 4,5.
OSF, Dünya Sağlık Örgütü tarafından %4-%6 malign dönüşüm oranı ile oral skuamöz hücreli karsinomlara ilerleme potansiyeli sergileyen yaygın bir oral potansiyel malign bozukluk (OPMD) olarak tanımlanmaktadır6,7,8,9. OSF’nin malign dönüşümünün altında yatan mekanizma kompleks10’dur. Hem displazi hem de atrofi dahil olmak üzere epitelin anormal büyümesi, karsinogenez potansiyelini arttırır ve stromadaki yaşlanan fibroblastlar, reaktif oksijen türleri (ROS) ve diğer moleküller yoluyla epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) indükleyerek OSF’nin malign ilerlemesinde rol oynayabilir10.
Mekansal-omik analizler için teknolojiler, kanser mekanizmaları hakkında içgörü sağlayan morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik veriler üretti11,12,13. Burada, lazer mikrodiseksiyon ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülü OSF dokusundan morfoloji ile ilişkili hücre popülasyonlarını yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu örneklerin multi-omik analizleri, doku içi heterojenlik ile ilgili zorlukların üstesinden gelebilir ve OSF14’teki moleküler patolojinin ve malign transformasyon mekanizmalarının anlaşılmasını artırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, lazer mikrodiseksiyon yoluyla daha fazla mekansal-omik analiz için morfolojik ve mekansal bilgilerle OSF doku örneklerini yakalamak için bir boru hattı bildirdi. Temsili sonuçlardan, morfoloji ile ilgili çeşitli örnekler arasında farklı CNA kalıpları belirledik.
OPMD’nin bir türü olan OSF, oral skuamöz hücreli karsinomun yaygın bir prekanseröz durumudur6. Genomik instabilitenin OPMD17,18’in<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81671006, 81300894), CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-038), Ulusal klinik anahtar disiplin inşaat projesi (PKUSSNKP-202102), Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (BMU2022BSS001) Üstün Doktora Adayları için İnovasyon Fonu.
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
Referências
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
