Dyrkning af rene astrocytter og mikroglia fra rygmarven hos voksne mus til in vitro-analyser og transkriptomiske undersøgelser
Summary
Denne protokol skitserer isoleringen af oprensede astrocytter og mikroglia fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter efterfølgende anvendelser såsom RNA-analyse og cellekultur. Det omfatter detaljerede celledissociationsmetoder og procedurer designet til at forbedre både kvaliteten og udbyttet af isolerede celler.
Abstract
Astrocytter og mikroglia spiller afgørende roller i udviklingen af centralnervesystemet, skaderesponser og neurodegenerative sygdomme. Disse meget dynamiske celler udviser hurtige reaktioner på miljøændringer og viser betydelig heterogenitet med hensyn til morfologi, transkriptionsprofiler og funktioner. Mens vores forståelse af gliacellernes funktioner i sundhed og sygdom er avanceret betydeligt, er der stadig behov for in vitro, cellespecifikke analyser udført i forbindelse med fornærmelser eller skader for omfattende at karakterisere forskellige cellepopulationer. Isolering af celler fra den voksne mus giver flere fordele i forhold til cellelinjer eller neonatale dyr, da det giver mulighed for analyse af celler under patologiske forhold og på bestemte tidspunkter. Desuden muliggør fokus på rygmarvsspecifik isolation, eksklusive hjerneinvolvering, forskning i rygmarvspatologier, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, rygmarvsskade og amyotrofisk lateral sklerose. Denne protokol præsenterer en effektiv metode til isolering af astrocytter og mikroglia fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter øjeblikkelig eller fremtidig analyse med potentielle anvendelser i funktionelle, molekylære eller proteomiske nedstrømsundersøgelser.
Introduction
Astrocytter og mikroglia er alsidige gliaceller, der spiller vitale roller i centralnervesystemet (CNS), der omfatter ansvar såsom regulering af neuronal funktion, bidrager til CNS-udvikling, opretholder blod-hjerne-barrieren og deltager i andre kritiske processer 1,2,3,4 . Udover deres rolle i at opretholde homeostase spiller disse gliaceller også en afgørende rolle i skade- og reparationsmekanismer. Microglia er kendt for deres fagocytiske, inflammatoriske og vandrende evner efter fornærmelser eller skader 5,6,7. Astrocytresponser i sygdom er lige så forskellige og omfatter bidrag til betændelse, dannelse af glia-ar og kompromiset mellem blod-hjerne-barrieren 8,9. Selvom vores forståelse af mikroglia og astrocytters skadelige og reparerende roller i CNS er vokset, kræver den iboende heterogenitet i både deres struktur og funktion robuste værktøjer til at studere dem i forskellige sammenhænge.
For at få yderligere indsigt i mikroglia og astrocytters rolle i sundhed og sygdom kræves en kombineret tilgang til in vivo – og in vitro-undersøgelser . In vivo-teknikker udnytter den indviklede krydstale mellem gliaceller og neuroner i CNS, mens in vitro-metoder viser sig værdifulde ved vurdering af enkeltcellefunktioner eller reaktioner under specifikke stimuli. Hver metode giver unikke fordele; In vitro-undersøgelser er afgørende for at forstå disse celletypers specifikke roller uden direkte eller indirekte input fra naboceller. Derudover giver in vitro-assays ved hjælp af udødelige cellelinjer visse fordele, herunder evnen til at sprede sig på ubestemt tid, omkostningseffektivitet og nem vedligeholdelse. Det er dog vigtigt at bemærke, at primære celler i højere grad efterligner normale fysiologiske reaktioner sammenlignet med cellelinjer. Denne fysiologiske relevans er afgørende i funktionelle assays og transkriptomiske analyser.
En af udfordringerne ved at opnå primære celler, især fra rygmarven hos voksne mus, ligger i mængden og levedygtigheden af prøverne. Den voksne rygmarv, der er mindre end hjernen og indeholder en betydelig mængde myelin, udgør unikke vanskeligheder. Mens der er flere offentliggjorte protokoller, der beskriver isoleringen af rene, levedygtige gliaceller fra neonatale dyr eller den voksne musehjerne 10,11,12,13, er disse metoder muligvis ikke egnede til at studere sygdomme og skader, der er specifikke for rygmarven. I denne protokol tilbyder vi en omfattende procedure til effektivt at isolere rene, levedygtige mikroglia og astrocytter fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter downstream-applikationer i cellekultur og transkriptomiske analyser. Denne protokol er med succes blevet anvendt til at isolere disse celler fra voksne mus i alderen 10 uger til 5 måneder, hvilket demonstrerer dens anvendelighed på tværs af forskellige sammenhænge, herunder undersøgelser, der involverer betingede knockout-mus, lægemiddelresponser, udviklingsforskning og aldersrelaterede modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering af rene, levedygtige primære celler er altafgørende for at undersøge strukturen og funktionen af specifikke celletyper. Hos den voksne mus, især i rygmarven, giver denne opgave betydelige udfordringer, da eksisterende protokoller ofte ikke er skræddersyet til den voksne rygmarv10,17. Denne protokol præsenterer en effektiv og omkostningseffektiv metode, der kan anvendes til forskellige downstream-applikationer, herunder cellekultur, flowcytometri, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Castle Raley ved George Washington University Genomics Core for RNA-analyser og Q2 Lab Solutions for RNA-sekventeringsanalyser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bevillingsnummer F31NS117085] og Vivian Gill Research Endowment til Dr. Robert H. Miller. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referências
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
