Isolering av rene astrocytter og mikroglia fra ryggmargen hos voksne mus for in vitro-analyser og transkriptomiske studier
Summary
Denne protokollen skisserer isoleringen av rensede astrocytter og mikroglia fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter påfølgende applikasjoner som RNA-analyse og cellekultur. Den inneholder detaljerte celledissosiasjonsmetoder og prosedyrer designet for å forbedre både kvaliteten og utbyttet av isolerte celler.
Abstract
Astrocytter og mikroglia spiller sentrale roller i utvikling av sentralnervesystemet, skaderesponser og nevrodegenerative sykdommer. Disse svært dynamiske cellene utviser raske responser på miljøendringer og viser betydelig heterogenitet når det gjelder morfologi, transkripsjonsprofiler og funksjoner. Mens vår forståelse av funksjonene til gliaceller i helse og sykdom har avansert betydelig, er det fortsatt behov for in vitro, cellespesifikke analyser utført i sammenheng med fornærmelser eller skader for å omfattende karakterisere forskjellige cellepopulasjoner. Isolering av celler fra den voksne musen gir flere fordeler i forhold til cellelinjer eller nyfødte dyr, da det muliggjør analyse av celler under patologiske forhold og på bestemte tidspunkter. Videre muliggjør fokus på ryggmargsspesifikk isolasjon, unntatt hjernens involvering, forskning på ryggmargspatologier, inkludert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, ryggmargsskade og amyotrofisk lateral sklerose. Denne protokollen presenterer en effektiv metode for å isolere astrocytter og mikroglia fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter umiddelbar eller fremtidig analyse med potensielle anvendelser i funksjonelle, molekylære eller proteomiske nedstrømsstudier.
Introduction
Astrocytter og mikroglia er allsidige gliaceller som spiller viktige roller i sentralnervesystemet (CNS), som omfatter ansvar som å regulere nevronfunksjonen, bidra til CNS-utvikling, opprettholde blod-hjernebarrieren og delta i andre kritiske prosesser 1,2,3,4 . Foruten deres rolle i å opprettholde homeostase, spiller disse gliacellene også en sentral rolle i skade- og reparasjonsmekanismer. Mikroglia er kjent for sine fagocytiske, inflammatoriske og migrerende evner etter fornærmelser eller skader 5,6,7. Astrocytresponser ved sykdom er like varierte, og omfatter bidrag til betennelse, dannelse av gliaarr og kompromiss av blod-hjernebarrieren 8,9. Selv om vår forståelse av de skadelige og reparerende rollene til mikroglia og astrocytter i CNS har vokst, krever den iboende heterogeniteten i både struktur og funksjon robuste verktøy for å studere dem i ulike sammenhenger.
Å få ytterligere innsikt i rollene til mikroglia og astrocytter i helse og sykdom krever en kombinert tilnærming av in vivo og in vitro undersøkelser. In vivo-teknikker utnytter den intrikate crosstalken mellom gliaceller og nevroner i CNS, mens in vitro-metoder viser seg å være verdifulle når man vurderer enkeltcellefunksjoner eller responser under spesifikke stimuli. Hver metode gir unike fordeler; In vitro-studier er avgjørende for å forstå de spesifikke rollene til disse celletypene uten direkte eller indirekte innspill fra naboceller. I tillegg gir in vitro-analyser ved bruk av udødelige cellelinjer visse fordeler, inkludert evnen til å spre seg på ubestemt tid, kostnadseffektivitet og enkel vedlikehold. Det er imidlertid viktig å merke seg at primære celler nærmer seg normale fysiologiske responser sammenlignet med cellelinjer. Denne fysiologiske relevansen er avgjørende i funksjonelle analyser og transkriptomiske analyser.
En av utfordringene med å skaffe primære celler, spesielt fra den voksne musens ryggmarg, ligger i mengden og levedyktigheten til prøvene. Den voksne ryggmargen, som er mindre enn hjernen og inneholder en betydelig mengde myelin, utgjør unike vanskeligheter. Mens det er flere publiserte protokoller som beskriver isolering av rene, levedyktige gliaceller fra nyfødte dyr eller den voksne musehjernen 10,11,12,13, kan disse metodene ikke være egnet for å studere sykdommer og skader som er spesifikke for ryggmargen. I denne protokollen tilbyr vi en omfattende prosedyre for effektivt å isolere rene, levedyktige mikroglia og astrocytter fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter nedstrøms applikasjoner i cellekultur og transkriptomiske analyser. Denne protokollen har blitt brukt til å isolere disse cellene fra voksne mus i alderen 10 uker til 5 måneder, og demonstrerer bruken i ulike sammenhenger, inkludert studier som involverer betingede knockoutmus, legemiddelresponser, utviklingsforskning og aldersrelaterte modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering av rene, levedyktige primærceller er avgjørende for å undersøke strukturen og funksjonen til spesifikke celletyper. Hos den voksne musen, spesielt i ryggmargen, byr denne oppgaven på betydelige utfordringer, da eksisterende protokoller ofte ikke er tilpasset den voksne ryggmargen10,17. Denne protokollen presenterer en effektiv og kostnadseffektiv metode som gjelder for ulike nedstrømsapplikasjoner, inkludert cellekultur, flowcytometri, histologi o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Castle Raley ved George Washington University Genomics Core for RNA-analyser og Q2 Lab Solutions for RNA-sekvenseringsanalyser. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke [tilskuddsnummer F31NS117085] og Vivian Gill Research Endowment til Dr. Robert H. Miller. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referências
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
