Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований
Summary
В этом протоколе описывается выделение очищенных астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, что облегчает последующие применения, такие как анализ РНК и культивирование клеток. Он включает в себя подробные методы и процедуры клеточной диссоциации, предназначенные для повышения качества и выхода изолированных клеток.
Abstract
Астроциты и микроглия играют ключевую роль в развитии центральной нервной системы, реакциях на травмы и нейродегенеративных заболеваниях. Эти высокодинамичные клетки демонстрируют быструю реакцию на изменения окружающей среды и демонстрируют значительную гетерогенность с точки зрения морфологии, транскрипционных профилей и функций. Несмотря на то, что наше понимание функций глиальных клеток в норме и при болезнях значительно продвинулось, по-прежнему существует потребность в клеточно-специфическом анализе in vitro, проводимом в контексте повреждений или травм, чтобы всесторонне охарактеризовать отдельные клеточные популяции. Изоляция клеток взрослой мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточными линиями или новорожденными животными, поскольку позволяет проводить анализ клеток в патологических условиях и в определенные моменты времени. Кроме того, сосредоточение внимания на специфической изоляции спинного мозга, исключая поражение головного мозга, позволяет исследовать патологии спинного мозга, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, травму спинного мозга и боковой амиотрофический склероз. Этот протокол представляет собой эффективный метод выделения астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, облегчающий немедленный или будущий анализ с потенциальными приложениями в функциональных, молекулярных или протеомных исследованиях.
Introduction
Астроциты и микроглия являются универсальными глиальными клетками, которые играют жизненно важную роль в центральной нервной системе (ЦНС), выполняя такие обязанности, как регуляция функции нейронов, содействие развитию ЦНС, поддержание гематоэнцефалического барьера и участие в других критических процессах 1,2,3,4 . Помимо своей роли в поддержании гомеостаза, эти глиальные клетки также играют ключевую роль в механизмах повреждения и восстановления. Микроглия хорошо известна своими фагоцитарными, воспалительными и миграционными способностями после инсультов или травм 5,6,7. Реакция астроцитов при заболевании столь же разнообразна, включая вклад в воспаление, образование глиальных рубцов и нарушение гематоэнцефалического барьера 8,9. Несмотря на то, что наше понимание пагубной и репаративной роли микроглии и астроцитов в ЦНС выросло, присущая им гетерогенность как в структуре, так и в функциях требует надежных инструментов для их изучения в различных контекстах.
Для получения более глубокого понимания роли микроглии и астроцитов в здоровье и заболевании требуется комбинированный подход исследований in vivo и in vitro . Методы in vivo используют сложные перекрестные помехи между глиальными клетками и нейронами в ЦНС, в то время как методологии in vitro оказываются полезными при оценке функций или ответов отдельных клеток под конкретными стимулами. Каждый метод обладает уникальными преимуществами; Исследования in vitro необходимы для понимания специфической роли этих типов клеток без прямого или косвенного влияния соседних клеток. Кроме того, анализы in vitro с использованием бессмертных клеточных линий имеют определенные преимущества, включая способность к бесконечному размножению, экономическую эффективность и простоту обслуживания. Тем не менее, важно отметить, что первичные клетки более точно имитируют нормальные физиологические реакции по сравнению с клеточными линиями. Эта физиологическая значимость имеет решающее значение в функциональных анализах и транскриптомных анализах.
Одна из проблем при получении первичных клеток, особенно из спинного мозга взрослой мыши, заключается в количестве и жизнеспособности образцов. Спинной мозг взрослого человека, будучи меньше головного мозга и содержащий значительное количество миелина, представляет собой уникальные трудности. Несмотря на то, что существует несколько опубликованных протоколов с подробным описанием выделения чистых, жизнеспособных глиальных клеток из неонатальных животных или головного мозга взрослой мыши 10,11,12,13, эти методики могут не подходить для изучения заболеваний и травм, специфичных для спинного мозга. В этом протоколе мы предлагаем комплексную процедуру эффективного выделения чистой, жизнеспособной микроглии и астроцитов из спинного мозга взрослой мыши, облегчая последующее применение в клеточных культурах и транскриптомных анализах. Этот протокол был успешно использован для изоляции этих клеток от взрослых мышей в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, демонстрируя его полезность в различных контекстах, включая исследования с участием мышей с условным нокаутом, реакцию на лекарственные препараты, исследования развития и возрастные модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение чистых, жизнеспособных первичных клеток имеет первостепенное значение для изучения структуры и функций конкретных типов клеток. У взрослых мышей, особенно в спинном мозге, эта задача представляет значительные трудности, поскольку существующие протоколы часто не адаптирова…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Castle Raley из Центра геномики Университета Джорджа Вашингтона за анализ РНК и Q2 Lab Solutions за анализ секвенирования РНК. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта [грант No F31NS117085] и Исследовательским фондом Вивиан Гилл доктору Роберту Х. Миллеру. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Referências
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
