Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) em um modelo murino de candidíase oral. A aPDT foi realizada usando uma mistura solúvel em água de curcuminóides e luz LED azul.

Resumo

A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) tem sido extensivamente investigada in vitro, e modelos animais pré-clínicos de infecções são adequados para avaliar tratamentos alternativos antes de ensaios clínicos. Este estudo descreve a eficácia da aPDT em um modelo murino de candidíase oral. Quarenta camundongos foram imunossuprimidos com injeções subcutâneas de prednisolona, e suas línguas foram inoculadas com swab oral previamente embebido em suspensão celular de C. albicans . A tetraciclina foi administrada via água potável durante o curso do experimento. Cinco dias após a inoculação fúngica, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em oito grupos; Um nono grupo de camundongos não infectados não tratados foi incluído como controle negativo (n = 5). Três concentrações (20 μM, 40 μM e 80 μM) de uma mistura de curcuminóides foram testadas com luz LED azul (89,2 mW/cm²; ~455 nm) e sem luz (grupos C+L+ e C+L-, respectivamente). Animais leves (C-L+), sem tratamento (C-L-) e sem infecção foram avaliados como controles. Os dados foram analisados por ANOVA de Welch e Games-Howell (α = 0,05). A candidíase oral foi estabelecida em todos os animais infectados e visualizada macroscopicamente através da presença de manchas brancas características ou pseudomembranas no dorso da língua. Cortes histopatológicos confirmaram grande presença de leveduras e filamentos limitados à camada queratinizada do epitélio no grupo C-L-, e a presença de células fúngicas foi visualmente diminuída nas imagens obtidas de camundongos submetidos à aPDT com curcuminóides de 40 μM ou 80 μM. A aPDT mediada por 80 μM de curcuminóides promoveu uma redução de 2,47 log₁₀ na contagem de colônias em comparação com aquelas no grupo C-L- (p = 0,008). Todos os outros grupos não apresentaram redução estatisticamente significativa no número de colônias, incluindo os grupos fotossensibilizador (C+L-) ou somente luz (C-L+). A aPDT mediada por curcuminóides reduziu a carga fúngica das línguas de camundongos.

Introdução

A candidíase oral (CO) é a principal infecção fúngica da cavidade oral; é causada pelo crescimento excessivo de Candida spp. Os fatores predisponentes para FO incluem disfunção endócrina, uso de antibióticos de amplo espectro, radioterapia e quimioterapia, deficiências nutricionais, xerostomia (baixo fluxo salivar), uso de próteses dentárias, falta de higiene e, principalmente, imunossupressão¹. Entre as espécies de Candida , Candida albicans é a mais prevalente e virulenta; É encontrada como uma espécie comensal no corpo humano e como um patógeno oportunista. C. albicans tem a capacidade de alterar sua morfo....

Protocolo

O protocolo de pesquisa para o uso de camundongos foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (processos números 05/2008 e 09/2020) da Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) foi utilizada como cepa de referência. Camundongos Swiss fêmeas com seis semanas de idade (n = 45), com uma faixa de massa corporal de 20-30 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram fornecidos pela Universidade Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.

1. Preparação do PS e seleção da fonte de luz para aPDT

1. Preparar o PS de acordo com as especificações da substância a ensaiar.
   ....

Resultados

O modelo murino de CO mostrou manchas brancas típicas e pseudomembranas na língua de todos os camundongos infectados (Figura 4A). C. albicans recuperados de animais C-L- confirmaram a colonização tecidual por este microrganismo (valores variaram de 1,62 x 10⁴ a 4,80 x 10⁵ UFC/mL). Como esperado, os animais do grupo NCtr não apresentaram alterações teciduais ou crescimento de colônias após a amostragem (Figura 4B).

Discussão

C. albicans tem sido associada a infecções orais e esofágicas em indivíduos com estado de imunocomprometimento, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos e higiene oral deficiente ^1,3. O estudo de doenças infecciosas humanas requer investigações in vitro e in vivo antes que os ensaios clínicos possam ser projetados com segurança e precisão. O presente estudo descreve um método para estabelecer um modelo murino de CO, que pode se.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, EUA)	90028	Usado para preparar a Centrífuga de inóculo de Candida
	Eppendorf  Centrífuga 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Alemanha	022628146 (NA)	Usada para preparar o inóculo de Candida
Cloreto de clorpromazina 2 mg/mL	Farmácia de manipulação, Araraquara, SP, Brasil	-	Usado para sedar animais durante a inoculação de candida
Sal solúvel em água à base de curcumina	PDTPharma, Cravinhos, Brasil	-	Consistindo em 53,4% de curcumina natural e 46,6% de outros curcuminóides (demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina). Preparado em água e N-MetilD-Glucamina (peso molecular médio final de 730,32 g.mol− 1)
Contador de colônias digital	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Cientí ficos Ltda, Araraquara, SP, Brasil	-	Usado para contar colônias em placas de ágar
Ração de rato extrudada	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindó ia, Sã o Estado de Paulo, Brasil.	-	Usado para a alimentação de camundongos
Cloridrato de cetamina 10%	Ketamina Agener, Uniã o Quí mica Farmacê utica Nacional S/A, Embu-Guaç u, SP, Brasil	-	Usado para anestesiar animais antes de tratamentos e para eutanásia
Peça de mão de diodo emissor de luz (protótipo)	Instituto de Fí sica de Sã o Carlos, Universidade de Sã o Paulo, Sã o Carlos, SP, Brasil	-	Fabricado com LXHL-PR09, Emissor Luxeon III, Lumileds Lighting, San Jose, Califórnia, EUA
Acetato de metilprednisolona 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, Nova York	-	Usado como imunossupressor
Micrótomo	Leica  Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Usado para cortar as seções seriadas das línguas
Caixas de propileno (alojamento de gaiolas) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirã o Preto, SP, Brasil	-	Usado para manter os animais durante todo o período experimental
Sabouraud Dextrose Agar com Cloranfenicol	HiMedia, Mumbai, Índia	MM1067-500G	Meio de cultura para crescimento de levedura (ágar)
Espectrofotômetro	Espectrofotômetro Kasvi K37-VIS, Sã o José dos Pinhais, PR, Brasil	K37-VIS	Usado para padronizar a concentração de inóculo
Cloridrato de tetraciclina	Farmácia de manipulação, Araraquara, SP, Brasil	-	Antibiótico administrado para induzir disbiose oral
Aparas de madeira	J.R. Aparas de madeira, Comércio de serragem Ltda., Conchal, Sã o Estado de Paulo, Brasil	-	Utilizado para revestimento de piso dentro das caixas de alojamento
Xylazine 2%	Calmiun, Uniã o Quí mica Farmacê utica Nacional S/A, Embu-Guaç u, SP, Brasil	-	Usado em combinação com cetamina para anestesia
Caldo de Nitrogênio de Levedura	Difco, InterLab, Detroit, MI, EUA	DF0919-07-3	Meio de cultura para o crescimento de leveduras (caldo)
Caldo de Levedura Peptona Dextrose	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Meio de cultura para manter as cepas em -80° C e crescer