تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي
Summary
البكتيريا (العاثيات) ، الفيروسات التي تصيب البكتيريا ، هي جزء لا يتجزأ من ميكروبيوم الأمعاء. على الرغم من أن هؤلاء السكان التكافليين يقودون اللياقة البكتيرية وديناميكيات السكان ، إلا أنه لا يفهم سوى القليل عن كيفية تأثيرها على توازن الأمعاء والمرض. يدرس هذا البروتوكول عاثيات T4 المعزولة داخل نموذج فأر ، قابلة للتكيف مع أزواج العاثيات البكتيرية الأخرى.
Abstract
البكتيريا (العاثيات) هي فيروسات تصيب البكتيريا بخصوصية على مستوى الأنواع والسلالة، وهي أكثر الكيانات البيولوجية وفرة في جميع النظم الإيكولوجية المعروفة. داخل المجتمعات البكتيرية ، مثل تلك الموجودة في ميكروبات الأمعاء ، فإن العاثيات متورطة في تنظيم ديناميكيات مجموعة الميكروبات ودفع التطور البكتيري. كان هناك اهتمام متجدد بأبحاث العاثيات في العقد الماضي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قدرات القتل الخاصة بالمضيف للعاثيات المحللة ، والتي توفر أداة واعدة لمواجهة التهديد المتزايد للبكتيريا المقاومة لمضادات الميكروبات. علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة التي تثبت أن العاثيات تلتصق بالمخاط المعوي إلى أنها قد يكون لها دور وقائي في منع الغزو البكتيري للظهارة الأساسية. الأهم من ذلك ، مثل الميكروبات البكتيرية ، ارتبطت البلعوم المعطلة بنتائج متفاقمة في أمراض مثل مرض التهاب الأمعاء. أظهرت الدراسات السابقة أن العاثيات يمكن أن تعدل ميكروبيوم والبشر من خلال عمليات زرع الترشيح البرازي ، مما يفيد صحة المضيف. مع هذه الموجة الأخيرة من الأبحاث تأتي ضرورة إنشاء وتوحيد بروتوكولات لدراسة العاثيات في سياق ميكروبيوم الأمعاء. يوفر هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات لدراسة عاثيات T4 المعزولة ومضيفها البكتيري ، الإشريكية القولونية ، في سياق الجهاز الهضمي للفئران. توضح الطرق الموضحة هنا كيفية البدء من تحلل العاثيات ، وإدارتها للفئران وتقييم التأثيرات على مستويات المضيف البكتيري والعاثيات. يمكن تعديل هذا البروتوكول وتطبيقه على أزواج العاثيات البكتيرية الأخرى ويوفر نقطة انطلاق لدراسة ديناميكيات العاثية المضيفة في الجسم الحي.
Introduction
البكتيريا ، أو العاثيات ، هي فيروسات تصيب وتقتل البكتيريا بالأنواع وخصوصية مستوى السلالة1. تلعب العاثيات أدوارا مهمة داخل المجتمعات البكتيرية المعقدة مثل ميكروبيوتا الأمعاء ، حيث تورطت في تنظيم ديناميكيات السكان وقيادة اللياقة البكتيرية2. طوال العقد الماضي ، كان هناك اهتمام متجدد بأبحاث العاثيات بسبب ظهور مسببات الأمراض المقاومة لمضادات الميكروبات3 ، وإمكانية العلاج بالعاثيات كاستراتيجية علاج بديلة. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام كوكتيلات العاثية lytic عن طريق الوريد مع بعض النجاح في الالتهابات الإنتانية البكتيرية الخطيرة المقاومة للمضادات الحيوية في البشر 3,4. كما تم اقتراح العلاج بالعاثيات عن طريق الفم كبديل محتمل للمضادات الحيوية لعلاج الالتهابات المعوية والالتهابات. علاوة على ذلك ، تورطت العاثيات في نجاح عمليات زرع الترشيح البرازي (FFT) ، وهي مستحضرات ميكروبيوتا برازية تم ترشيحها لإزالة البكتيريا ، في علاج عدوى المطثية العسيرة المتكررة (rCDI) 5,6 ، واضطرابات الأمعاء الالتهابية (IBD) 7,8 والتهاب الأمعاء والقولون الناخر في الخنازير قبل الأوان9. بالنظر إلى هذه النتائج ، من المهم النظر في التفاعلات بين كل من العاثيات وميكروبات الأمعاء ، والعاثيات ومضيف الثدييات ، لأن إضافة العاثيات الجديدة إلى مجتمع موجود مسبقا قد يكون له آثار غير مباشرة على المجتمع ككل ، وليس فقط البكتيريا المستهدفة2،10.
أثبتت دراسة تفاعلات العاثيات مع البكتيريا المستهدفة في المختبر أنها مفيدة لفهم آليات وتأثيرات تفاعلات العاثيات والبكتيريا في الأمعاء. في هذا الإعداد ، تبين أن العاثيات T4 الخاصة بالإشريكية القولونية من رتبة Caudovirales تتطلب مجالات شبيهة بالغلوبولين المناعي (Ig) تقع داخل بروتينات قفيصة خارجية عالية الاستضفاف (Hoc) على سطح virion للالتصاق بالمخاط المعوي11. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت فحوصات transwell أن العاثيات T4 قادرة على التفاعل مع ثقافات الخلايا الظهارية والانتقال عبر طبقات الخلايا عن طريق كثرة الخلايا الكبيرة12,13. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن العاثيات يمكن أن تتفاعل مع مضيفها الميتازوان ، على الرغم من أنها غير قادرة على إصابة الخلايا حقيقية النواة. هذه النماذج ، على الرغم من فائدتها ، تفتقر إلى مجموعة كاملة من التفاعلات المعقدة التي تحدث في النظام البيئي للأمعاء المطلوبة لاستكشاف شامل للتفاعل الثلاثي بين العاثيات والبكتيريا ومضيف metazoan.
تعد نماذج الماوس أداة مهمة للتحقيق في العاثيات داخل البيئات المعقدة. التطبيق المرغوب فيه لإدارة العاثيات هو كاستراتيجية بديلة لعلاج الالتهابات المقاومة لمضادات الميكروبات أو الأمراض المرتبطة بالأمراض الالتهابية المزمنة ، بما في ذلك مرض التهاب الأمعاء. ومع ذلك ، تشير الأدبيات الناشئة إلى أن سلوك العاثيات في المختبر لا يمثل بشكل كامل وظائف الجسم الحي . أظهر Buttimer et al.14 أن كوكتيل العاثية كان قادرا على استنفاد البكتيريا المستهدفة في اتحاد ميكروبيوتا بشري مبسط في المختبر ، ولكن لا يمكن تكراره في الجسم الحي في الفئران gnotobiotic المستعمرة بنفس اتحاد البكتيريا والعاثيات. علاوة على ذلك ، في ميكروبيوم الفئران التقليدي ، أدت العاثية T7 إلى استنفاد انتقائي لبكتيريا الأمعاء المستهدفة ، على الرغم من ملاحظة الانتعاش التدريجي بمرور الوقت ، مما يدل على تطور المقاومة15. أظهرت دراسات أخرى تعايش العاثيات التي يتم تناولها عن طريق الفم والسلالات البكتيرية المستهدفة في الجسم الحي2،16. في الواقع ، بالإضافة إلى التعايش بين العاثيات والبكتيريا ، أدت إدارة العاثيات إلى تغييرات واسعة النطاق في التكوين العام لمجتمع الجراثيم ووظيفتها2،16. هذا مهم في إعدادات المرض حيث وجدت العديد من الدراسات ارتباطات بين زيادة الوفرة النسبية ل Caudovirales و IBD7،8،17 التي كانت مستقلة عن التغيرات في وفرة البكتيريا7. لا يزال من غير المعروف ما إذا كان هذا هو المحرك أو نتيجة لمرض المرض.
كان التركيز التاريخي للتحقيق في العاثيات حول العلاقة بين العاثية والبكتيريا المستهدفة. ومع ذلك ، من المهم أيضا مراعاة التفاعلات المحتملة بين العاثية والغشاء المخاطي والظهارة والجهاز المناعي لمضيف metazoan. تلعب جميع هذه التفاعلات دورا مهما في الاستجابة الشاملة لعدوى العاثيات المعوية. لإثبات ذلك ، تمت دراسة العاثيات باستخدام الفئران الخالية من الجراثيم (GF) لتوضيح تأثيرها على الجهاز المناعي دون تدخل من قبل الجراثيم8. في هذا النظام ، تم الكشف عن الأحماض النووية العاثية بواسطة مستقبلات تشبه الرسوم (TLRs) الموجودة داخل إندوسومات الخلايا المناعية البلعمية (الضامة والخلايا المتغصنة). أدى هذا إلى تنشيط إشارات المصب وتحفيز الإنتاج المعتمد على الخلايا التائية للإنترفيرون (IFN) –γ 8 أو IFNs من النوع الأول18. علاوة على ذلك ، تورط Fluckiger et al.19 خلايا الذاكرة CD8 + T في التعرف على المستضدات المشفرة بالعاثيات (prophage) ، مما أدى إلى تفاعل الخلايا التائية مع مستضدات الورم ، مما أدى إلى تقليل عبء الورم. أخيرا ، تم توثيق إنتاج الأجسام المضادة الخاصة بالعاثيات في دراسات الفئران حيث تم تسليم العاثيات إلى النماذج الحيوانية بطريقة مستمرة من خلال مياه الشرب 8,20 ، أو عن طريق التزويج الفموي المتكرر على مدى عدة أشهر20 ، مما يدل على قدرة بروتينات العاثيات على تعزيز الاستجابات المناعية الخلطية. على الرغم من أن هذه الأنماط من التلقيح بالعاثيات تسمح بالتحضير الأمثل والمستمر للجهاز المناعي ، إلا أنها قد لا تمثل التفاعلات التي تحدث بشكل طبيعي بين العاثيات والبيئة المعوية ، ولا حركية العلاج بالعاثيات المطبقة عن طريق الفم. حتى الآن ، فحص عدد محدود من الدراسات تفاعلات العاثية مع نوع بكتيري واحد في نماذج الفئران أحادية القولون21. ومع ذلك ، أثبتت الفئران أحادية القولون أهميتها في فك رموز التأثيرات الخاصة بالميكروبات للأنواع الفردية على الجهاز الهضمي (GI) وتطور المناعة22،23،24 ، وقد تثبت فائدتها في فهم التفاعلات الثلاثية بين العاثيات والبكتيريا المستهدفة ومضيف metazoan.
بشكل مثير ، لا يزال هناك الكثير لنتعلمه عن التفاعلات بين العاثية المعوية والبكتيريا المتعايشة مع الأمعاء ، بالإضافة إلى التفاعلات التي تحدث بين مضيف metazoan والعاثيات الموجودة داخله. يوفر هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات لدراسة عاثية T4 المعزولة ونظيرتها البكتيرية ، E. coli (K-12 ، BW25113) ، باستخدام نموذج فأر gnotobiotic. توفر هذه الإجراءات الموحدة أيضا أساسا لتحسين ثنائيات العاثيات / البكتيريا الأخرى من خلال تكييف معلمات النمو مع الأزواج ذات الاهتمام. توضح الطرق الموضحة هنا: (1) تحضير T4 phage و sysates المركبات للتزويج الفموي للفئران. (2) إعطاء العاثية T4 عن طريق الفم إلى الفئران gnotobiotic أحادية القولون E. ؛ (3) مراقبة مستويات العاثية T4 في براز وأنسجة الفئران بمرور الوقت.
بالنسبة للنتائج التمثيلية المعروضة هنا ، تم نشر محللات العاثية T4 المنقاة من مخزونات بنك العاثيات التي يحتفظ بها مختبر Rohwer. تم تكييف طريقة Phage-on-Tap لنشر العاثية T425 ، كما هو مشار إليه في هذا البروتوكول. تنتج هذه الطريقة مخزونا عاليا من العاثيات منخفضة العيار والسموم الداخلية في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا النهج ، تم جمع 10 مل من ≥ 1010 وحدات تشكيل البلاك (pfu) / مل من العاثية T4 مع < 0.5 وحدة من السموم الداخلية (EU) / مل بشكل روتيني. مستويات السموم الداخلية الموصى بها للإعطاء عن طريق الفم أو الوريد في الفئران هي ≤ 20 EU / mL و ≤ 5 EU / kg / h (أو 0.1 EU تدار على مدار ساعة واحدة للفأر 20 جم) ، على التوالي ، مما يجعل هذه طريقة مناسبة لإعداد العاثيات للتلقيح في الجسم الحي . تم تخزين جميع مخزونات العاثيات عند 4 درجات مئوية في محلول عاثي المغنيسيوم الملحي (SM) (الوصفة المقدمة في الخطوة 1.1.5.1). تمت زراعة الإشريكية القولونية في وسائط LB. بالنسبة لأزواج البكتيريا العاثية المختلفة ، يمكن تكييف وسائط الثقافة المتنوعة وظروف النمو من هذا البروتوكول. يمكن أيضا الحصول على العاثيات من البيئة ، مثل مياه الصرف الصحي والمياه البحرية والتربة والمحتويات المعوية ويمكن عزلها وتنقيتها وفقا ل Sambrook و Russell26 قبل التحضير باستخدام ظروف النمو والانتشار المناسبة لكل زوج من العاثيات المضيفة25. بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على العاثيات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) أو من بنوك العاثيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل دراسة العاثيات في الميكروبيوم تحديا كبيرا مقارنة بنظيراتها البكتيرية. على وجه التحديد ، لا تحتوي العاثيات على علامة تطورية محفوظة مشتركة بين جميع العاثيات المشابهة للوحدات الفرعية الريبوسومية 16S و 18S التي تسمح بسهولة تسلسل وتحديد الأنواع بدائية النواة وحقيقية النواة ، على التوالي<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بأن الأرض التي أجروا عليها هذا البحث هي الأراضي التقليدية والأجداد وغير المعترف بها لأمة xwməθkwəy̓əm (Musqueam). لطالما كانت الأرض التي تقع عليها مكانا للتعلم لشعب Musqueam ، الذين انتقلوا لآلاف السنين في ثقافتهم وتاريخهم وتقاليدهم من جيل إلى آخر في هذا الموقع. نحن نشجع الآخرين على معرفة المزيد عن الأراضي الأصلية التي يعيشون ويعملون فيها في https://native-land.ca. يقر المؤلفون بالدعم المقدم من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) المنح الدراسية الكندية للخريجين – الماجستير (NP) ، جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية BC للمتدربين (RT-2023-3174 ، إلى MH) ، برنامج المنح الاستكشافية لمجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (RGPIN-2019-04591 إلى CT ، RGPIN-2016-04282 إلى LCO) ، المعهد الكندي للبحوث المتقدمة / البشر والميكروبيوم (FL-001253 Appt 3362 ، إلى CT) ، وجائزة مؤسسة مايكل سميث للباحثين في مجال البحوث الصحية (18239 ، إلى CT) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-159458 إلى LCO) والمؤسسة الكندية للابتكار (34673 إلى LCO و 38277 إلى CT). نحن ممتنون للدعم الفني من مركز UBC لنمذجة الأمراض و ubcFLOW ، الذي تدعمه مبادرة المرونة البيولوجية UBC GREx ، ولأعضاء مختبرات Osborne و Tropini للمناقشات النقدية وتقييم المخطوطة. تم إنشاء الشكل 1A والشكل 2A باستخدام Biorender.com.
Materials
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
Referências
- Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
- Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
- Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
- Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
- Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
- Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
- Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
- Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
- Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
- Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
- Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
- Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
- Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
- Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
- Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
- Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
- Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
- Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
- Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
- Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
- Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2001).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
- Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Louten, J. Chapter 7 – Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
- Richter, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
- . Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices Available from: https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit (2018)
- Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
- Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
- Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
- Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
- McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
- Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
- Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
- Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
- Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
- Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
- Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
- Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
- Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem’s influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
- Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth’s Most Diverse Inhabitants. Wholon. , (2014).
- Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
- Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
- Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
- Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Kutter, E., Sulakvelidze, A. . Bacteriophages: Biology and Applications. , (2004).
- Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).
