Her er en protokoll for dyrking av placenta explants under konstante strømningsforhold. Denne tilnærmingen forbedrer tradisjonelle statiske villøse kultursystemer ved å muliggjøre replikering av dynamiske fysiologiske miljøer.
De eksisterende ex vivo placentaplantekulturmodellene er primært forankret i statiske kultursystemer ved bruk av brønnplater. Imidlertid reflekterer disse modellene utilstrekkelig dynamikken i utero-innstillingen, hvor morkaken møter konstant liten skjærspenning på grunn av plasma eller blodstrøm. For å møte denne begrensningen er det utviklet et strømningskultursystem for å bringe ex vivo placentaplantedyrking nærmere de in utero strømningsforholdene som oppleves i mors kropp. Innenfor denne tilnærmingen dyrkes placentaplanter i en sekvens av fem sammenkoblede strømningskamre. Denne innstillingen opprettholder fysiologiske oksygenkonsentrasjoner og en konsistent strømningshastighet. De innsamlede dataene viser at under strømningsforhold viser bevaring av vevsmorfologi merkbar forbedring sammenlignet med konvensjonelle statiske metoder. Denne innovative teknikken introduserer et enkelt middel til ex vivo placentaplantekultur, og tilbyr en mer trofast representasjon av det dynamiske in vivo-miljøet. Videre introduserer denne studien nye muligheter for å undersøke den funksjonelle dynamikken i feto-mors grensesnitt. Ved å omfavne gjennomførbare dynamiske metoder, blir det lettere å forstå placentabiologien, noe som understreker dens relevans for mors fosterhelse.
Siden 1960-tallet har dyrking av placentaplanter på bunnen av en brønnplate blitt brukt til å studere feto-mors grensesnitt 1,2,3. Denne metoden er veletablert og grei, og muliggjør bruk av humant vev for ulike studier, i tillegg til kulturer av enkeltceller 2,3. Over tid har eksperimentelle design for placentaplantekulturer blitt modifisert med hensyn til oksygenkonsentrasjon4 og for å forhindre at vevet legger seg på brønnplatens bunn 2,5,6. Denne metoden har imidlertid ikke blitt tilpasset in vivo-forholdene i livmoren, spesielt tilstedeværelsen av en konstant strømning3.
Suksessen til en graviditet avhenger av en tilstrekkelig og konsistent perfusjon av det intervillous rommet med mors blod, og etablerer en dynamisk krets med kontinuerlig innstrømning og utstrømning av blod og blodbårne stoffer 7,8,9,10,11,12. Morkaken har to forskjellige blodforsyningssystemer, en for mors blod og en for fosterblod, noe som resulterer i dobbel perfusjon av både foster- og morssystemer13. Mors blod begynner å perfusere morkakens intervillous rom i slutten av første trimester, sakte strømmer gjennom utvidede livmor spiralarterier10,11,14. Følgelig blir placenta villøse trær badet i mors blod, og leverer næringsstoffer og oksygen til fosteret. Dette mors blod strømmer gjennom det intervillous rommet før det går tilbake til mors sirkulasjon via uteroplacental vener. Under passasjen gjennom det intervillous rommet fører diffusjon og aktivt opptak av oksygen og næringsstoffer i fosterblod til lavere oksygen- og næringsnivåer i mors blod12,15. Imidlertid er det intervillous rommets blod helt erstattet av friskt, oksygenrikt blod omtrent to til tre ganger per minutt, noe som sikrer kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer og gasser13. Spesielt er syncytiotrofoblasten, den ytterste delen av placentabarrieren, den eneste komponenten i placentavilletreet som er direkte utsatt for mors blod15,16,17. Følgelig opplever syncytiotrofoblasten en konstant mild skjærspenning fra det flytende morsblodet 3,14.
Nåværende vitenskapelig kunnskap om placentastrømningsmiljøet og moderne tekniske fremskritt tillater nå en tilpasset og fysiologisk tilnærmet dyrking av placentaplanter under strømningsforhold. Videre tyder bevis på at skjærkrefter påvirker de biologiske funksjonene til syncytiotrofoblasten 18,19,20,21. En velkjent tilnærming som står for blodstrømmen er placenta dual lobe perfusjonssystem22. Imidlertid krever disse forsøkene betydelig kompetanse, er tidsbegrenset (utført i bare noen få timer), og er bare gjennomførbare med tredje trimester placentaprøver 3,23. I kontrast har vi utviklet en enkel og ikke-påtrengende teknikk for ex vivo placenta villøs eksplantkultur under konstante strømningsinnstillinger, imøtekommende både første og tredje trimester placentavev3. I dette oppsettet dyrkes placentaplanter i fem seriekoblede strømningskamre. Villøse eksplanter festes til kammerets bunn ved hjelp av nålformede forhøyninger på tynne metallplater. Den konstruerte strømningskretsen overføres deretter til en bioreaktor, hvor både oksygenkonsentrasjon og strømningshastighet reguleres3. Strømningskulturresultater viser at vevets integritet er bedre bevart sammenlignet med den typisk brukte statiske metoden3. Videre muliggjør denne dynamiske tilnærmingen nye og tilpassede eksperimentelle design for vevseksplantdyrking, noe som muliggjør in vitro-eksperimenter som nærmere etterligner det naturlige miljøet3.
Denne studien introduserer et unikt perspektiv på en strømningskulturteknikk for placentaplanter designet for å gjenskape dynamikken i utero miljø 3,23. Funnene viser at morfologien til vev dyrket under strømningsbetingelser er bedre bevart sammenlignet med den tradisjonelle statiske dyrkingsmetoden3. Spesielt, selv om verken statiske eller strømningskulturelle forhold muliggjør perfusjon av placentakar, ble ødeleggelsen av feto-placenta blodkar inne i villøs stroma hovedsakelig observert i statisk kultur, mens integriteten til blodkar syntes å være bedre opprettholdt over lengre varighet i strømningskultur3.
En mulig forklaring på denne observasjonen kan knyttes til syncytiotrofoblastens avgjørende beskyttende og endokrine rolle, en funksjon som er godt dokumentert i litteraturen 12,24,25,26. Gitt dette er det tenkelig at den generelle integriteten til det ytre laget av villi bidrar betydelig til vedlikehold av den underliggende stroma, inkludert blodkarene. Følgelig kan den vedvarende cellulære integriteten til blodkarene under strømningsforhold tilskrives den kontinuerlige strømmen av mediet. Denne bevegelsen hjelper til med passiv bevegelse av eksplantene, noe som letter utvekslingen av gasser, næringsstoffer og nanopartikler (som ekstracellulære vesikler) over placentabarrieren. Dette kan i sin tur positivt påvirke bevaringen av blodkarmorfologi. Videre spiller fenomenet mekanosensasjon en rolle i vevsmorfogenese over forskjellige vev27,28. Studier har vist at mekanosensitivitet påvirker cellulære prosesser på flere nivåer, og utløser en rekke biokjemiske responser som til slutt påvirker vev og organfunksjonalitet29. Spesielt uttrykkes mekanosensitive proteiner av syncytiotrofoblasten gjennom hele svangerskapet28. Videre antyder studien at mikrovilli på vevsoverflaten kan være involvert i denne sammenhengen28.
Et ekstra perspektiv verdt å vurdere er mitokondriens potensielle rolle i den cellulære responsen på strømning. For eksempel, i endotelceller, tjener mitokondrier som signaltransdusere for cellulære responser på miljøstimuli30. Økt akkumulering av lipiddråper, observert i statisk dyrket vev gjennom TEM3, har vært assosiert med apoptoseinduksjon på grunn av mitokondriell dysfunksjon31. Ytterligere undersøkelser er nødvendige for å avdekke de underliggende mekanismene og nøkkelfaktorene, og knytte dem til nedstrøms signalveier. Denne utforskningen kan forbedre vår forståelse av hvordan vevet oppfatter og reagerer på skjærspenning, og oversettes til forbedret levedyktighet og integritet av villøse eksplanter i kultur23.
Flere kritiske protokolltrinn må gjentas og utføres med forsiktighet. Etter placentafødsel bør vevet dyrkes så raskt som mulig. Under forberedelse av eksplanter er det avgjørende å unngå områder med synlige infarkter. Forsiktig håndtering av eksplanter med tang for å forhindre klemming er viktig. Det anbefales å holde vevet dekket med væske gjennom hele prosedyren og gjennomføre det raskt.
Det er viktig å erkjenne at denne studien ikke er i stand til å spesifisere den eksakte skjærspenningen i det presenterte strømningssystemet, noe som bør betraktes som en begrensning i fremtidige undersøkelser 3,23. Likevel er det viktig å erkjenne at presis strømningshastighet og skjærspenning for en bestemt placenta villus in vivo påvirkes av mange parametere, for eksempel de geometriske egenskapene til det intervillous rommet, villusens plassering i dette rommet, og dens nærhet og vinkel til mors spiralarterier og livmorvener 3,19,23,32 . Kompleksiteten i morkakens geometriske struktur, som varierer mellom individer, må også tas i betraktning23,32. Matematiske modeller som estimerer blodstrømmen i det intervilløse rommet32 og beregninger på veggskjærspenning på syncytiotrofoblasten19,28 eksisterer allerede. Interessant nok spådde en studie at skjærspenningen på syncytiotrofoblasten er lavere i tredje trimester sammenlignet med første trimester28, mens en annen viste romlig heterogen veggskjærspenning på syncytiotrofoblast19. Bestemmelse av nøyaktig strømningshastighet og skjærspenning for en bestemt placenta villus er fortsatt en utfordring 3,19,23,32. Slike beregninger gir en tilnærming av skjærspenningsområdet for fremtidige undersøkelser, men de kan kreve løpende anatomiske justeringer og optimalisering23. Videre kan fremtidige studier utvikle nye og raffinerte strømningskulturteknikker som står for den intrikate geometrien i det intervillous rommet og strategier for å øke antall prøver per eksperiment3. Det forventes kontinuerlig fremgang og utvikling av strømningssystemet, potensielt ved bruk av alternative strømningskamre (Brugger et al., upubliserte data, 2023).
Avslutningsvis legger denne studien et robust grunnlag ved å demonstrere en lett implementerbar ex vivo strømningskulturteknikk som opprettholder den strukturelle integriteten til dyrkede villøse eksplanter. Det understreker betydningen av dynamiske teknikker i placenta funksjonelle biologistudier, baner vei for videre fremskritt i strømningskultursystemer og generering av nye ideer og hypoteser 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne setter pris på den utmerkede tekniske støtten fra Bettina Amtmann og Petra Winkler for vevsprøvetaking. Denne forskningen ble finansiert av det østerrikske vitenskapsfondet FWF (DOC 31-B26) og Medical University of Graz, Østerrike, gjennom PhD-programmet Inflammatoriske lidelser i svangerskapet (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |