JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären in vitro för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

Blod-hjärnbarriären (BBB) har en avgörande roll för att upprätthålla en stabil och hälsosam hjärnmiljö. BBB-dysfunktion är förknippad med många neurologiska sjukdomar. Vi har utvecklat en 3D, stamcellsbaserad modell av BBB för att undersöka cerebrovaskulär patologi, BBB-integritet och hur BBB förändras av genetik och sjukdom.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) är en viktig fysiologisk komponent i det centrala nervsystemet (CNS), som upprätthåller näringsämnen, rensar avfall och skyddar hjärnan från patogener. De inneboende barriäregenskaperna hos BBB utgör en utmaning för terapeutisk läkemedelsleverans till CNS för att behandla neurologiska sjukdomar. Nedsatt BBB-funktion har kopplats till neurologisk sjukdom. Cerebral amyloidangiopati (CAA), avsättning av amyloid i hjärnans kärl som leder till en komprometterad BBB, är en komorbiditet i de flesta fall av Alzheimers sjukdom (AD), vilket tyder på att BBB-dysfunktion eller nedbrytning kan vara involverad i neurodegeneration. På grund av begränsad tillgång till mänsklig BBB-vävnad är mekanismerna som bidrar till korrekt BBB-funktion och BBB-degeneration fortfarande okända. För att ta itu med dessa begränsningar har vi utvecklat en human pluripotent stamcellshärledd BBB (iBBB) genom att införliva endotelceller, pericyter och astrocyter i en 3D-matris. iBBB monterar sig själv för att rekapitulera anatomin och cellulära interaktioner som finns i BBB. Sådd av iBBB med amyloid fångar viktiga aspekter av CAA. Dessutom erbjuder iBBB en flexibel plattform för att modulera genetiska och miljömässiga faktorer som är inblandade i cerebrovaskulär sjukdom och neurodegeneration, för att undersöka hur genetik och livsstil påverkar sjukdomsrisken. Slutligen kan iBBB användas för läkemedelsscreening och läkemedelskemiska studier för att optimera terapeutisk leverans till CNS. I detta protokoll beskriver vi differentieringen av de tre typerna av celler (endotelceller, pericyter och astrocyter) som härrör från humana pluripotenta stamceller, hur man sätter ihop de differentierade cellerna till iBBB och hur man modellerar CAA in vitro med hjälp av exogent amyloid. Denna modell övervinner utmaningen att studera levande mänsklig hjärnvävnad med ett system som har både biologisk trohet och experimentell flexibilitet, och möjliggör förhör av den mänskliga BBB och dess roll i neurodegeneration.

Introduction

Blod-hjärnbarriären (BBB) är ett viktigt mikrovaskulärt nätverk som separerar det centrala nervsystemet (CNS) från periferin för att upprätthålla en idealisk miljö för korrekt neuronal funktion. Det har en avgörande roll för att reglera inflödet och utflödet av ämnen till CNS genom att upprätthålla metabolisk homeostas 1,2,3,4, rensa avfall 4,5,6 och skydda hjärnan från patogener och toxiner 7,8.

Den primära celltypen av BBB är endotelcellen (EC). Endotelceller, härstammande från mesodermlinjen, bildar kärlväggarna 1,9. Mikrovaskulära EC:er bildar täta korsningar med varandra för att kraftigt minska permeabiliteten hos deras membran 10,11,12,13,14 samtidigt som transportörer uttrycks för att underlätta förflyttningen av näringsämnen in i och ut ur CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulära ECs är omgivna av pericyter (PCs)-muralceller som reglerar mikrovaskulär funktion och homeostas och är avgörande för att reglera permeabiliteten hos BBB för molekyler och immunceller 15,16,17. Astrocyten, en viktig gliacellstyp, är den slutliga celltypen som består av BBB. Astrocyternas ändfötter lindas runt EC-PC-kärlrören medan cellkropparna sträcker sig in i hjärnans parenkym och bildar en förbindelse mellan nervceller och kärl1. Distinkta lösta ämnen och substrattransportörer är lokaliserade på astrocyternas ändfötter (t.ex. aquaporin 4 [AQP-4]) som har en kritisk roll i BBB-funktion 18,19,20,21.

BBB är avgörande för att upprätthålla korrekt hjärnhälsofunktion, och dysfunktion av BBB har rapporterats vid många neurologiska sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD) 22,23,24,25, multipel skleros 7,26,27,28, epilepsi 29,30 och stroke31,32. Det är alltmer erkänt att cerebrovaskulära abnormiteter spelar en central roll i neurodegeneration, vilket bidrar till ökad känslighet för ischemiska och hemorragiska händelser. Till exempel har mer än 90 % av AD-patienterna cerebral amyloid angiopati (CAA), ett tillstånd som kännetecknas av avsättning av amyloid β (Aβ) längs hjärnans kärl. CAA ökar BBB-permeabiliteten och minskar BBB-funktionen, vilket gör CNS sårbart för ischemi, hemorragiska händelser och accelererad kognitiv försämring33.

Vi har nyligen utvecklat en in vitro-modell av humant BBB, härledd från patientinducerade pluripotenta stamceller, som innehåller EC, PC och astrocyter inkapslade i en 3D-matris (Figur 1A). iBBB rekapitulerar fysiologiskt relevanta interaktioner, inklusive kärlrörsbildning och lokalisering av astrocytändfötter med vaskulatur24. Vi använde iBBB för att modellera känsligheten hos CAA medierad av APOE4 (figur 1B). Detta gjorde det möjligt för oss att identifiera de kausala cellulära och molekylära mekanismerna genom vilka APOE4 främjar CAA, och utnyttja dessa insikter för att utveckla terapeutiska strategier som minskar CAA-patologi och förbättrar inlärning och minne in vivo i APOE4-möss24. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll och videohandledning för att rekonstruera BBB från humana iPSC:er och modellera CAA in vitro.

Protocol

1. Differentiera iPSCs till iBBB-celler OBS: Dessa differentieringsprotokoll har tidigare beskrivits i Mesentier-Louro et al.34. Beläggning av cellodlingsplattorUpptining reducerade membranmatrisen med tillväxtfaktor (GF) över natten vid 4 °C. Späd 500 μl basalmembranmatris i 49,5 ml DMEM. Förvara denna lösning kall för att förhindra för tidig polymerisation av beläggningslösningen. Tillsätt 1-2 ml per brunn a…

Representative Results

En korrekt formad iBBB stelnar till en enda genomskinlig skiva (figur 3A). Det är normalt att iBBB lossnar från ytan där den först pipetterades efter några dagar. Detta kan inte undvikas, men är inte ett stort problem för den korrekta bildningen av iBBB om försiktighet iakttas vid byte av media för att inte oavsiktligt aspirera iBBB. Efter 24 timmar, jämnt fördelade, kan enskilda celler identifieras under ett ljusfältsmikroskop (figur 3B). Efter 2 ve…

Discussion

BBB-dysfunktion är en komorbiditet och potentiellt en orsak eller förvärrande faktor i många neurologiska sjukdomar 7,40,41. Det är dock nästan omöjligt att studera den molekylär- och cellbiologi som ligger till grund för dysfunktion och nedbrytning av BBB hos människor med neurovaskulär sjukdom. Den inducerbara BBB (iBBB) som presenteras i detta protokoll ger ett in vitro-system som rekapitulerar viktiga cel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation och Brain Injury Association of America. C.G. stöds av NIH F31NS130909. Figur 1A skapades med BioRender.com.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy
check_url/65921?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image