バイオリファイナリーアプローチによる紅海藻 Gracilaria gracilis の価値化
Summary
ここでは、 Gracilaria gracilisの統合的な価値化を目的としたいくつかのプロトコル(野生種の収穫、自社栽培、生物活性成分の抽出)について説明します。抽出物の抗酸化作用、抗菌作用、細胞毒性作用が評価され、海藻バイオマスと色素が豊富に含まれた食品の栄養と安定性の評価も行われます。
Abstract
海藻は、貴重でマルチターゲットの生物活性成分を得るための豊富な原料として、継続的に高まっています。本研究では、化粧品、薬理学、食品、飼料用途の寒天やその他の原料の供給源として商業的に利益を得るために世界中で養殖されている食用紅海藻である Gracilaria gracilisの可能性を探ります。
G. gracilis の生育条件は、栄養繁殖と胞子形成によって最適化され、物理化学的条件を操作して大量のバイオマスストックを達成しました。エタノールと水を用いた緑色抽出法は、海藻バイオマスに対して実施されました。抽出物の生理活性の可能性は、細胞毒性、抗酸化性、および抗菌特性に関する一連の in vitro アッセイを通じて評価されました。さらに、乾燥海藻バイオマスをパスタの配合に取り入れ、食品の栄養価を高めました。 また、G. gracilis から抽出した色素は、天然着色料としてヨーグルトに配合され、その安定性が評価されました。どちらの製品も、市場に出る前に最高の最終処方を達成することを目指して、半訓練された官能パネルの評価に提出されました。
結果は、 G. gracilis がバイオマス全体、抽出物および/または色素として適用されるかどうかにかかわらず、その多様性を裏付けています。この作業は、いくつかの最適化されたプロトコルを実装することで、食品、化粧品、水産養殖市場に利益をもたらす可能性のある製品の開発を可能にし、環境の持続可能性とブルーサーキュラーエコノミーを促進します。
さらに、バイオリファイナリーのアプローチに沿って、残留海藻バイオマスは植物成長のためのバイオスティミュラントとして使用されたり、ポルトガルのレイリアにあるMARE-Polytechnicの社内養殖システムの水質浄化に使用される炭素材料に変換されます。
Introduction
海藻類は、医薬品、食品、飼料、環境分野で利益を得るための興味深い天然原料と見なすことができます。それらは、関連する生物学的特性を持つ、陸生生物には見られない多くの分子を生合成します1,2。しかし、大量のバイオマスストックを確保するためには、海藻に最適化された培養プロトコルを実施する必要があります。
養殖方法は、海藻の性質と全体的な形態を常に考慮する必要があります。 Gracilaria gracilis はクローン分類群であり、付着器官は複数の栄養軸を生成します。このようにして、断片化による伝播(栄養繁殖)が達成され、これらの軸のそれぞれが主葉状体3から独立した生命を完全に採用することができる。クローン分類群は、葉状体を小さな断片に分割することで大量のバイオマスが得られ、それが急速に再生し、遺伝的に同一の新しい個体に成長するため、単純で迅速なワンステップ培養方法とうまく統合できます。このプロセスでは、ハプロンティックタリーとディプロンティックタリーの両方を使用できます。この属は複雑なハプロ-ディプロンティック同型三相性生活環を示すが、改良作物を達成するために株の遺伝的更新が必要な場合を除き、胞子形成はめったに必要ではない。この場合、四胞子(減数分裂によって形成されるハプロン胞子)と手肉胞子(有糸分裂によって形成される双発胞子)の両方が巨視的なタリーを生じさせ、栄養繁殖によって成長および繁殖することができる4。成長サイクルは、着生植物の出現や他の生物の付着などの他の生物学的要因の中でも、環境条件と個体の生理学的状態によって決定されます。したがって、高い生産性を確保し、良質なバイオマスを生産するためには、生育条件の最適化が不可欠です5。
G. gracilisを含む海藻からの生理活性化合物の抽出は、さまざまな方法で達成できます6,7。抽出方法の選択は、対象化合物、目的とする用途、海藻の特性によって異なります。本研究では、海藻バイオマスから水やエタノールなどの緑色溶媒を用いて生理活性物質を溶解・抽出する溶媒抽出に着目しました。抽出は、多用途で効果的な方法でマセラシオンによって行うことができ、幅広い化合物に使用できます。これは、バイオマスを溶媒に長時間浸す、通常は室温またはわずかに高温で行う、シンプルで広く使用されている方法です。溶媒を攪拌して、抽出プロセスを強化します。所望の抽出時間の後、溶媒は濾過または遠心分離によって固体材料から分離される。
水は、その安全性、入手可能性、および幅広い食品との適合性により、食品用途で一般的に使用される溶媒です。水抽出は、多糖類、ペプチド、特定のフェノール類などの極性化合物に適しています。ただし、非極性化合物を効果的に抽出できない場合があります。エタノールは、食品用途でも広く使用されている溶媒であり、フェノール化合物、フラボノイド、特定の色素など、さまざまな生理活性分子の抽出に効果的です。エタノールは一般的に食品に安全に使用できると認識されており、簡単に蒸発して抽出された化合物を残します。抽出方法の選択では、効率、選択性、費用対効果、環境への影響などの要因を考慮する必要があることは注目に値します。溶媒濃度、抽出時間、温度、圧力などの抽出パラメータの最適化は、 G. gracilis やその他の海藻由来の生理活性化合物の最適な収量を達成するために重要です。
海藻類は、細菌、真菌、ウイルスなど、幅広い微生物に対して抗菌活性を示すことがわかっています8。この活性は、フェノール類、多糖類、ペプチド、脂肪酸などの生理活性成分に起因します。いくつかの研究は、 大腸菌、 黄色ブドウ球菌、 サルモネラ 属菌、 緑膿菌などの病原体に対する有効性を実証しています9。海藻の抗菌活性は、微生物の細胞壁、膜、酵素、およびシグナル伝達経路を妨害する可能性のある生理活性化合物の存在に起因します10。これらの化合物は、微生物の増殖を阻害し、バイオフィルムの形成を阻害し、免疫応答を調節する可能性があります。
紅海藻は、シャク植物とも呼ばれ、さまざまな微生物に対して抗菌活性を示すことができる藻類のグループです。このグループ内では、 G. gracilis には、報告されている抗菌活性に寄与する可能性のあるさまざまな生理活性化合物が含まれています。特定の分子はさまざまですが、 G. gracilis で報告され、抗菌特性を持つ可能性のある一般的なクラスは、多糖類、フェノール類、テルペノイド、および色素です11。ただし、これらの成分の存在と量は、海藻の収集場所、季節性、タリーの生理学的条件、環境条件などの要因によって異なる可能性があることに注意することが重要です。したがって、 G. gracilis の抗菌化合物の特定のクラスと濃度は、それに応じて異なる場合があります。
G. gracilis は、フリーラジカルを除去し、酸化ストレスを軽減することが示されているさまざまなフェノール化合物を含む抗酸化特性を保持することもわかっています12。抗酸化物質は、活性酸素種によって引き起こされる損傷から細胞を保護するのに役立ち、潜在的な健康上の利点があります。抗酸化能は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)フリーラジカル捕捉活性など、さまざまな方法で直接評価でき、間接的には総ポリフェノール含有量(TPC)の定量化を通じて評価できます13。
成分は顕著な生理活性を有すると報告されていますが、その細胞毒性評価は、生きた細胞や組織と接触して使用される天然および合成物質を評価するために不可欠です。細胞毒性の測定にはいくつかの方法があり、それぞれに利点と限界があります。全体として、それらは、細胞に対する多くの物質の有害な影響を評価すると同時に、細胞の損傷と死のメカニズムを調査するためのさまざまなオプションを提供します14。
この研究では、Mosmann (1983)15によって導入された比色法である3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイを使用します。この方法は、代謝活性細胞によるテトラゾリウム塩の紫色のホルマザン生成物への還元を測定します。ホルマザン結晶の量が多いほど、生細胞の数が多くなり、細胞毒性の間接的な測定値が得られます14。この研究では、 G. gracilis の水とエタノール抽出物を皮膚化粧品の製剤に組み込むことを意図しているため、 in vitro 細胞毒性評価はケラチノサイト(HaCaT)細胞株で行われます。
食品用途に関しては、海藻は一般的に低カロリーで、食物繊維、必須元素、アミノ酸、多糖類、多価不飽和脂肪酸、ポリフェノール、ビタミンが豊富です2,16。G. gracilisも例外ではなく、興味深い栄養価を持っています。Freitas et al. (2021)4 は、養殖された G. gracilis は、野生の海藻と比較して、タンパク質とビタミン C のレベルが高く、総脂質のレベルを維持することを発見しました。これは、栄養学的に言えば、野生資源の開発よりも生産が好ましいため、経済的および環境的利点を表す可能性があります。さらに、消費者は自分が食べる食品の種類にますます関心を持っているため、食品を豊かにするための新しい成分を導入し、新しいリソースを使用して、製品に付加価値を与え、「クリーンラベル」を主張できる抽出物を入手することが重要です。その上、現在の市場は非常に競争が激しく、メーカーを競合他社と差別化するための新製品と革新的な戦略の開発が必要です17。
パスタなどの栄養価の低い商品に海藻などの水産資源を豊富に含め、新たな食品として導入する戦略であり、栄養価の異なる商品による市場の差別化戦略です。一方、 G. gracilis はフィコビリタンパク質18などの天然赤色色素の供給源であり、食品産業への応用が期待されています。この海藻はいくつかの分野で高い関心を示しており、その適用は海藻全体、抽出物、および/または残りのバイオマスを使用して行うことができます。この作業では、そのようなアプリケーションの例をいくつか示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
液体培地中の抗菌活性試験は、液体培地に懸濁した微生物に対する抗菌物質の有効性を評価するために使用され、通常、微生物の成長を阻害または殺す物質の能力を決定するために実行されます35、36、37、38.それらは、抗菌剤に対する微生物の感受性を評価するために使用され、試験管または微?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、MARE-Marine and Environmental Sciences Centre(UIDP/04292/2020およびUIDB/04292/2020)およびAssociate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)に付与された戦略的プロジェクトを通じて、ポルトガル科学技術財団(FCT)の支援を受けました。FCTはまた、Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)とTatiana Pereira(2021.07791. BD)。この作業は、ポルトガル2020プログラムの下でERDF(欧州地域開発基金)が共同出資するプロジェクトHP4A(すべての人のための健康的なパスタ)(共同プロモーション番号039952)によっても財政的に支援され、COMPETE 2020 – 競争力と国際化運用プログラムを通じて行われました。
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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