Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde från ex vivo eller in vitro cellkulturer till transkriptomisk förbehandling av data för kostnadseffektiv transkriptombaserad läkemedelsscreening.
Transkriptomik gör det möjligt att få omfattande insikter i cellulära program och deras svar på störningar. Trots en betydande minskning av kostnaderna för biblioteksproduktion och sekvensering under det senaste decenniet är det fortfarande oöverkomligt dyrt att tillämpa denna teknik i den skala som krävs för läkemedelsscreening, vilket hindrar den enorma potentialen hos dessa metoder. Vår studie presenterar ett kostnadseffektivt system för transkriptombaserad läkemedelsscreening, som kombinerar miniatyriserade störningskulturer med mini-bulktranskriptomik. Det optimerade mini-bulk-protokollet ger informativa biologiska signaler på kostnadseffektivt sekvenseringsdjup, vilket möjliggör omfattande screening av kända läkemedel och nya molekyler. Beroende på vald behandling och inkubationstid kommer detta protokoll att resultera i sekvenseringsbibliotek inom cirka 2 dagar. På grund av flera stopppunkter inom detta protokoll kan biblioteksförberedelsen, såväl som sekvenseringen, utföras tidsoberoende. Det är möjligt att bearbeta ett stort antal prover samtidigt. Mätning av upp till 384 prover testades utan förlust av datakvalitet. Det finns inte heller några kända begränsningar för antalet tillstånd och/eller läkemedel, trots att man tar hänsyn till variabilitet i optimala inkubationstider för läkemedel.
Utvecklingen av nya läkemedel är en komplex och tidskrävande process som innebär att identifiera potentiella läkemedel och deras mål, optimera och syntetisera läkemedelskandidater och testa deras effektivitet och säkerhet i prekliniska och kliniska prövningar1. Traditionella metoder för läkemedelsscreening, dvs. systematisk utvärdering av bibliotek av kandidatföreningar för terapeutiska ändamål, involverar användning av djurmodeller eller cellbaserade analyser för att testa effekterna på specifika mål eller vägar. Även om dessa metoder har varit framgångsrika när det gäller att identifiera läkemedelskandidater, har de ofta inte gett tillräckliga insikter om de komplexa molekylära mekanismer som ligger till grund för läkemedelseffekt och även toxicitet och mekanismer för potentiella biverkningar.
Att bedöma transkriptionstillstånd i hela genomet är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att övervinna nuvarande begränsningar i läkemedelsscreening, eftersom det möjliggör omfattande bedömningar av genuttryck som svar påläkemedelsbehandlingar. Genom att mäta RNA-transkript på ett genomomfattande sätt som uttrycks vid en given tidpunkt, syftar transkriptomik till att ge en helhetsbild av de transkriptionsförändringar som uppstår som svar på läkemedel, inklusive förändringar i genuttrycksmönster, alternativ splitsning och icke-kodande RNA-uttryck3. Denna information kan användas för att bestämma läkemedelsmål, förutsäga läkemedelseffekt och toxicitet och optimera läkemedelsdosering och behandlingsregimer.
En av de viktigaste fördelarna med att kombinera transkriptomik med opartisk läkemedelsscreening är möjligheten att identifiera nya läkemedelsmål som inte tidigare har övervägts. Konventionella metoder för läkemedelsscreening fokuserar ofta på etablerade målmolekyler eller målvägar, vilket hindrar identifieringen av nya mål och potentiellt resulterar i läkemedel med oförutsedda biverkningar och begränsad effektivitet. Transkriptomik kan övervinna dessa begränsningar genom att ge insikter i de molekylära förändringar som uppstår som svar på läkemedelsbehandling, vilket avslöjar potentiella mål eller vägar som kanske inte tidigare har övervägts2.
Förutom identifiering av nya läkemedelsmål kan transkriptomik också användas för att förutsäga läkemedels effekt och toxicitet. Genom att analysera de genuttrycksmönster som är associerade med läkemedelssvar kan biomarkörer utvecklas som kan användas för att förutsäga en patients svar på ett visst läkemedel eller behandlingsregim. Detta kan också bidra till att optimera läkemedelsdoseringen och minska risken för negativa biverkningar4.
Trots dess potentiella fördelar är kostnaden för transkriptomik fortfarande ett betydande hinder för dess utbredda tillämpning vid läkemedelsscreening. Transkriptomisk analys kräver specialiserad utrustning, teknisk expertis och dataanalys, vilket kan göra det utmanande för mindre forskargrupper eller organisationer med begränsad finansiering att använda transkriptomik i läkemedelsscreening. Kostnaden för transkriptomik har dock stadigt minskat, vilket gör det mer tillgängligt för forskarsamhället. Dessutom har framsteg inom teknik och dataanalysmetoder gjort transkriptomiken mer effektiv och kostnadseffektiv, vilket ytterligare ökar tillgängligheten2.
I detta protokoll beskriver vi ett högdimensionellt och explorativt system för transkriptombaserad läkemedelsscreening, som kombinerar miniatyriserade störningskulturer med mini-bulk transkriptomikanalys 5,6. Med detta protokoll är det möjligt att minska kostnaden per prov till 1/6av den nuvarande kostnaden för kommersiella lösningar för mRNA-sekvensering i full längd. Protokollet kräver endast standardlaboratorieutrustning, det enda undantaget är användningen av kortläsningssekvenseringsteknik, som kan läggas ut på entreprenad om sekvenseringsinstrument inte finns tillgängliga internt. Det optimerade mini-bulk-protokollet ger informationsrika biologiska signaler på kostnadseffektivt sekvenseringsdjup, vilket möjliggör omfattande screening av kända läkemedel och nya molekyler.
Syftet med experimentet är att screena för läkemedelsaktivitet på PBMC i olika biologiska sammanhang. Detta protokoll kan tillämpas på alla biologiska frågor där flera läkemedel bör testas med en transkriptomisk avläsning, vilket ger en transkriptomomfattande bild av den cellulära effekten av behandlingen.
Läkemedelsupptäckt och läkemedelsutveckling kan dra stor nytta av den helhetssyn på cellulära processer som bulktranskriptomik kan ge. Ändå begränsas detta tillvägagångssätt ofta av den höga kostnaden för experimentet med standard bulk RNA-seq-protokoll, vilket förbjuder dess tillämpning i akademiska miljöer såväl som dess potential för industriell skalbarhet.
De mest kritiska stegen i protokollet är cellupptining och de första stegen i biblioteksförberedelserna. Att säk…
The authors have nothing to disclose.
J.L.S. stöds av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) enligt Tysklands excellensstrategi (EXC2151-390873048), samt under SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, det BMBF-finansierade excellensprojektet Diet-Body-Brain (DietBB); och EU-projektet SYSCID under bidragsnummer 733100. M.B. stöds av DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. stöds av DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – projektnummer 513977171) och Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Bilder som skapats med BioRender.com.
50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |