基于转录组学的经济高效的药物筛选
Summary
该协议描述了从 离体 或 体外 细胞培养到转录组数据预处理的工作流程，以实现具有成本效益的基于转录组的药物筛选。
Abstract
转录组学可以全面了解细胞程序及其对扰动的反应。尽管在过去十年中，文库生产和测序的成本显著降低，但以药物筛选所需的规模应用这些技术仍然非常昂贵，阻碍了这些方法的巨大潜力。我们的研究提出了一种具有成本效益的基于转录组的药物筛选系统，将小型扰动培养物与小型批量转录组学相结合。优化的小型批量实验方案以经济高效的测序深度提供信息丰富的生物信号，从而能够对已知药物和新分子进行广泛筛选。根据所选的处理和孵育时间，该方案将在大约 2 天内产生测序文库。由于该协议中有多个停止点，因此文库制备和测序可以不受时间限制地进行。可以同时处理大量样品;对多达 384 个样品的测量进行了测试，而不会降低数据质量。尽管考虑了最佳药物孵育时间的可变性，但对条件和/或药物的数量也没有已知的限制。
Introduction
新药开发是一个复杂且耗时的过程，涉及识别潜在药物及其靶点、优化和合成候选药物，以及在临床前和临床试验中测试其有效性和安全性1。传统的药物筛选方法，即用于治疗目的的候选化合物库的系统评估，涉及使用动物模型或基于细胞的测定来测试对特定靶标或通路的影响。虽然这些方法在识别候选药物方面取得了成功，但它们往往不能对药物疗效背后的复杂分子机制以及潜在副作用的毒性和机制提供足够的见解。
评估全基因组转录状态是克服当前药物筛选局限性的有力方法，因为它可以全面评估响应药物治疗的基因表达2。通过以全基因组方式测量在给定时间表达的 RNA 转录本，转录组学旨在提供响应药物时发生的转录变化的整体视图，包括基因表达模式、选择性剪接和非编码 RNA 表达的变化3。这些信息可用于确定药物靶点，预测药物疗效和毒性，并优化药物剂量和治疗方案。
将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要好处之一是有可能识别以前未考虑过的新药物靶点。传统的药物筛选方法通常侧重于已建立的靶点分子或通路，阻碍了新靶点的识别，并可能导致药物具有不可预见的副作用和有限的有效性。转录组学可以通过深入了解药物治疗后发生的分子变化来克服这些局限性，发现以前可能未考虑过的潜在靶点或途径2.
除了鉴定新的药物靶点外，转录组学还可用于预测药物疗效和毒性。通过分析与药物反应相关的基因表达模式，可以开发可用于预测患者对特定药物或治疗方案的反应的生物标志物。这也有助于优化药物剂量并降低不良副作用的风险4.
尽管转录组学具有潜在的好处，但其成本仍然是其在药物筛选中广泛应用的重大障碍。转录组学分析需要专门的设备、技术专长和数据分析，这可能使小型研究团队或资金有限的组织难以在药物筛选中使用转录组学。然而，转录组学的成本一直在稳步下降，使其更容易被研究界所接受。此外，技术和数据分析方法的进步使转录组学更加高效和具有成本效益，进一步提高了其可及性2。
在该方案中，我们描述了一种用于基于转录组的药物筛选的高维和探索性系统，将小型化扰动培养物与小型批量转录组学分析相结合5,6。使用该方案，可以将每个样品的成本降低到目前全长mRNA测序商业解决方案成本的1/6。该协议仅需要标准实验室设备，唯一的例外是使用短读长测序技术，如果内部没有测序仪器，则可以将其外包。优化的小型批量实验方案以具有成本效益的测序深度提供信息丰富的生物信号，从而能够对已知药物和新分子进行广泛筛选。
该实验的目的是筛选不同生物学背景下 PBMC 的药物活性。该方案可以应用于任何生物学问题，其中几种药物应该用转录组读数进行测试，从而提供治疗的细胞效应的转录组范围视图。
Protocol
Representative Results
Discussion
药物发现和药物开发可以从批量转录组学提供的细胞过程的整体视图中受益匪浅。然而，这种方法往往受到标准批量RNA-seq实验方案的高成本的限制，阻碍了其在学术环境中的应用以及其工业可扩展性的潜力。
该方案最关键的步骤是细胞解冻和文库制备的初始步骤。确保解冻后细胞的高活力对于成功的治疗和转录组学分析至关重要。细胞收获和文库制备的第一步，直到cDNA合成…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. 由德国研究基金会 （DFG） 根据德国卓越战略 （EXC2151-390873048） 以及 SCHU 950/8-1 提供支持;GRK 2168，TP11;CRC SFB 1454 Metaflammation、IRTG GRK 2168、WGGC INST 216/981-1、CCU INST 217/988-1、BMBF 资助的卓越项目 Diet-Body-Brain （DietBB）;以及欧盟项目 SYSCID，资助号为 733100。M.B. 由 DFG （IRTG2168-272482170， SFB1454-432325352） 提供支持。L.B.得到了DFG（ImmuDiet BO 6228/2-1 – 项目编号513977171）和德国卓越战略（EXC2151-390873048）的支持。使用 BioRender.com 创建的图像。
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Referências
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
