Omkostningseffektiv transkriptomisk baseret lægemiddelscreening
Summary
Denne protokol beskriver en arbejdsgang fra ex vivo eller in vitro cellekulturer til transkriptomisk dataforbehandling til omkostningseffektiv transkriptombaseret lægemiddelscreening.
Abstract
Transcriptomics giver mulighed for at få omfattende indsigt i cellulære programmer og deres reaktioner på forstyrrelser. På trods af et betydeligt fald i omkostningerne til biblioteksproduktion og -sekventering i det seneste årti er det fortsat uoverkommeligt dyrt at anvende disse teknologier i det omfang, der er nødvendigt for lægemiddelscreening, hvilket hindrer disse metoders enorme potentiale. Vores undersøgelse præsenterer et omkostningseffektivt system til transkriptombaseret lægemiddelscreening, der kombinerer miniaturiserede forstyrrelseskulturer med mini-bulk transkriptomics. Den optimerede mini-bulk-protokol giver informative biologiske signaler ved omkostningseffektiv sekventeringsdybde, hvilket muliggør omfattende screening af kendte lægemidler og nye molekyler. Afhængigt af den valgte behandlings- og inkubationstid vil denne protokol resultere i sekventering af biblioteker inden for ca. 2 dage. På grund af flere stoppunkter inden for denne protokol kan bibliotekets forberedelse såvel som sekventering udføres tidsuafhængigt. Behandling samtidig af et stort antal prøver er mulig; Måling af op til 384 prøver blev testet uden tab af datakvalitet. Der er heller ingen kendte begrænsninger for antallet af tilstande og / eller lægemidler, på trods af at der tages hensyn til variabilitet i optimale lægemiddelinkubationstider.
Introduction
Udviklingen af nye lægemidler er en kompleks og tidskrævende proces, der involverer identifikation af potentielle lægemidler og deres mål, optimering og syntetisering af lægemiddelkandidater og test af deres effektivitet og sikkerhed i prækliniske og kliniske forsøg1. Traditionelle metoder til lægemiddelscreening, dvs. systematisk vurdering af biblioteker af kandidatforbindelser til terapeutiske formål, involverer anvendelse af dyremodeller eller cellebaserede assays til at teste virkningerne på specifikke mål eller veje. Mens disse metoder har været vellykkede til at identificere lægemiddelkandidater, gav de ofte ikke tilstrækkelig indsigt i de komplekse molekylære mekanismer, der ligger til grund for lægemiddeleffektivitet og også toksicitet og mekanismer for potentielle bivirkninger.
Vurdering af genom-dækkende transkriptionelle tilstande præsenterer en stærk tilgang til at overvinde de nuværende begrænsninger i lægemiddelscreening, da det muliggør omfattende vurderinger af genekspression som reaktion på lægemiddelbehandlinger2. Ved at måle RNA-transkripter på en genom-bred måde udtrykt på et givet tidspunkt sigter transkriptomics mod at give et holistisk billede af de transkriptionelle ændringer, der opstår som reaktion på lægemidler, herunder ændringer i genekspressionsmønstre, alternativ splejsning og ikke-kodende RNA-ekspression3. Disse oplysninger kan bruges til at bestemme lægemiddelmål, forudsige lægemiddeleffektivitet og toksicitet og optimere lægemiddeldosering og behandlingsregimer.
En af de vigtigste fordele ved at kombinere transkriptomics med upartisk lægemiddelscreening er potentialet til at identificere nye lægemiddelmål, der ikke tidligere er blevet overvejet. Konventionelle metoder til screening af lægemidler fokuserer ofte på etablerede målmolekyler eller -veje, hvilket hindrer identifikationen af nye mål og potentielt resulterer i lægemidler med uforudsete bivirkninger og begrænset effektivitet. Transcriptomics kan overvinde disse begrænsninger ved at give indsigt i de molekylære ændringer, der opstår som reaktion på lægemiddelbehandling, afdække potentielle mål eller veje, der måske ikke tidligere er blevet overvejet2.
Ud over identifikation af nye lægemiddelmål kan transkriptomics også bruges til at forudsige lægemiddeleffektivitet og toksicitet. Ved at analysere genekspressionsmønstre forbundet med lægemiddelresponser kan der udvikles biomarkører, der kan bruges til at forudsige en patients respons på et bestemt lægemiddel eller behandlingsregime. Dette kan også bidrage til at optimere lægemiddeldosering og reducere risikoen for bivirkninger4.
På trods af dets potentielle fordele er omkostningerne ved transkriptomik fortsat en betydelig barriere for dets udbredte anvendelse i lægemiddelscreening. Transkriptomisk analyse kræver specialudstyr, teknisk ekspertise og dataanalyse, hvilket kan gøre det udfordrende for mindre forskerhold eller organisationer med begrænset finansiering at bruge transkriptomik i lægemiddelscreening. Imidlertid har omkostningerne ved transkriptomik været støt faldende, hvilket gør det mere tilgængeligt for forskersamfundene. Derudover har fremskridt inden for teknologi og dataanalysemetoder gjort transkriptomik mere effektiv og omkostningseffektiv, hvilket yderligere øger tilgængeligheden2.
I denne protokol beskriver vi et højdimensionelt og udforskende system til transkriptombaseret lægemiddelscreening, der kombinerer miniaturiserede forstyrrelseskulturer med mini-bulk transkriptomics-analyse 5,6. Med denne protokol er det muligt at reducere omkostningerne pr. prøve til 1/6af de nuværende omkostninger ved kommercielle løsninger til mRNA-sekventering i fuld længde. Protokollen kræver kun standard laboratorieudstyr, den eneste undtagelse er brugen af kortlæste sekventeringsteknologier, som kan outsources, hvis sekventeringsinstrumenter ikke er tilgængelige internt. Den optimerede mini-bulk-protokol giver informationsrige biologiske signaler ved omkostningseffektiv sekventeringsdybde, hvilket muliggør omfattende screening af kendte lægemidler og nye molekyler.
Formålet med forsøget er at screene for lægemiddelaktivitet på PBMC’er i forskellige biologiske sammenhænge. Denne protokol kan anvendes på ethvert biologisk spørgsmål, hvor flere lægemidler skal testes med en transkriptomisk aflæsning, hvilket giver et transkriptom-bredt overblik over behandlingens cellulære virkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lægemiddelopdagelse og lægemiddeludvikling kan i høj grad drage fordel af det holistiske syn på cellulære processer, som bulktranskriptomik kan give. Ikke desto mindre er denne tilgang ofte begrænset af de høje omkostninger ved eksperimentet med standard bulk RNA-seq-protokol, der forbyder dets anvendelse i akademiske omgivelser såvel som dets potentiale for industriel skalerbarhed.
De mest kritiske trin i protokollen er celleoptøning og de indledende trin i biblioteksforberedelsen. S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. støttes af den tyske forskningsfond (DFG) under Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048) samt under SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, det BMBF-finansierede ekspertiseprojekt Diet-Body-Brain (DietBB); og EU-projektet SYSCID under bevillingsnummer 733100. M.B. støttes af DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). LB støttes af DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – projektnummer 513977171) og Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Billeder oprettet med BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Referências
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
