लागत प्रभावी ट्रांसक्रिप्टोमिक-आधारित ड्रग स्क्रीनिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो या इन विट्रो सेल संस्कृतियों से लागत प्रभावी ट्रांसक्रिप्टोम-आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा प्री-प्रोसेसिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।
Abstract
ट्रांसक्रिप्टोमिक्स सेलुलर कार्यक्रमों में व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और गड़बड़ी के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं की अनुमति देता है। पिछले दशक में पुस्तकालय उत्पादन और अनुक्रमण की लागत में उल्लेखनीय कमी के बावजूद, दवा स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक पैमाने पर इन तकनीकों को लागू करना निषेधात्मक रूप से महंगा है, इन तरीकों की अपार क्षमता में बाधा डालता है। हमारा अध्ययन ट्रांसक्रिप्टोम-आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी प्रणाली प्रस्तुत करता है, जो मिनी-बल्क ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के साथ लघु गड़बड़ी संस्कृतियों का संयोजन करता है। अनुकूलित मिनी-बल्क प्रोटोकॉल लागत प्रभावी अनुक्रमण गहराई पर सूचनात्मक जैविक संकेत प्रदान करता है, जिससे ज्ञात दवाओं और नए अणुओं की व्यापक जांच सक्षम होती है। चुने हुए उपचार और इनक्यूबेशन समय के आधार पर, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप लगभग 2 दिनों के भीतर पुस्तकालयों को अनुक्रमित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के भीतर कई रोक बिंदुओं के कारण, पुस्तकालय की तैयारी, साथ ही अनुक्रमण, समय-स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है। एक साथ प्रसंस्करण नमूनों की एक बड़ी संख्या संभव है; डेटा गुणवत्ता के नुकसान के बिना 384 नमूनों तक के माप का परीक्षण किया गया था। इष्टतम दवा इनक्यूबेशन समय में परिवर्तनशीलता पर विचार करने के बावजूद, स्थितियों और / या दवाओं की संख्या के लिए कोई ज्ञात सीमाएं नहीं हैं।
Introduction
नई दवाओं का विकास एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है जिसमें संभावित दवाओं और उनके लक्ष्यों की पहचान करना, दवा उम्मीदवारों को अनुकूलित और संश्लेषित करना और प्रीक्लिनिकल औरनैदानिक परीक्षणों में उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का परीक्षण करना शामिल है। दवा स्क्रीनिंग के लिए पारंपरिक तरीकों, यानी, चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए उम्मीदवार यौगिकों के पुस्तकालयों के व्यवस्थित मूल्यांकन, विशिष्ट लक्ष्यों या मार्गों पर प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पशु मॉडल या सेल आधारित assays का उपयोग शामिल है. हालांकि ये विधियां दवा उम्मीदवारों की पहचान करने में सफल रही हैं, लेकिन वे अक्सर दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता और संभावित दुष्प्रभावों के तंत्र के अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्र में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं।
जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शनल राज्यों का आकलन दवा स्क्रीनिंग में वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह दवा उपचार2 के जवाब में जीन अभिव्यक्ति के व्यापक आकलन को सक्षम बनाता है। एक निश्चित समय में व्यक्त एक जीनोम-वाइड फैशन में आरएनए टेप को मापने से, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उद्देश्य जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, वैकल्पिक स्प्लिसिंग और गैर-कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति3 में परिवर्तन सहित दवाओं के जवाब में होने वाले ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का समग्र दृष्टिकोण प्रदान करना है। इस जानकारी का उपयोग दवा के लक्ष्यों को निर्धारित करने, दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने और दवा की खुराक और उपचार के नियमों को अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है।
निष्पक्ष दवा स्क्रीनिंग के साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के संयोजन के प्रमुख लाभों में से एक नए दवा लक्ष्यों की पहचान करने की क्षमता है जिन्हें पहले नहीं माना गया है। पारंपरिक दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण अक्सर स्थापित लक्ष्य अणुओं या मार्गों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, नए लक्ष्यों की पहचान में बाधा डालते हैं और संभावित रूप से अप्रत्याशित दुष्प्रभावों और प्रतिबंधित प्रभावशीलता वाली दवाओं के परिणामस्वरूप होते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक्स दवा उपचार के जवाब में होने वाले आणविक परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करके इन सीमाओं को दूर कर सकता है, संभावित लक्ष्यों या मार्गों को उजागर कर सकता है जिन्हें पहले2 नहीं माना जा सकता था।
नए दवा लक्ष्यों की पहचान के अलावा, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए भी किया जा सकता है। दवा प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करके, बायोमार्कर विकसित किए जा सकते हैं जिनका उपयोग किसी विशेष दवा या उपचार के लिए रोगी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है। यह दवा की खुराक को अनुकूलित करने और प्रतिकूल दुष्प्रभावों के जोखिम को कम करने में भी मदद करसकता है।
इसके संभावित लाभों के बावजूद, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की लागत दवा स्क्रीनिंग में इसके व्यापक अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए विशेष उपकरण, तकनीकी विशेषज्ञता और डेटा विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जो दवा स्क्रीनिंग में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग करने के लिए सीमित धन वाले छोटे शोध टीमों या संगठनों के लिए चुनौतीपूर्ण बना सकता है। हालांकि, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की लागत लगातार कम हो रही है, जिससे यह अनुसंधान समुदायों के लिए अधिक सुलभ हो गया है। इसके अतिरिक्त, प्रौद्योगिकी और डेटा विश्लेषण विधियों में प्रगति ने ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को अधिक कुशल और लागत प्रभावी बना दिया है, जिससे इसकी पहुंचबढ़ गई है 2.
इस प्रोटोकॉल में, हम प्रतिलेख आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च आयामी और खोजपूर्ण प्रणाली का वर्णन, मिनी थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विश्लेषण 5,6 के साथ miniaturbation गड़बड़ी संस्कृतियों के संयोजन. इस प्रोटोकॉल के साथ, पूर्ण लंबाई वाले एमआरएनए अनुक्रमण के लिए वाणिज्यिक समाधानों की वर्तमान लागत के प्रति नमूना लागत को 1/6वें तक कम करना संभव है। प्रोटोकॉल के लिए केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है, एकमात्र अपवाद लघु-पठन अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग होता है, जिसे आउटसोर्स किया जा सकता है यदि अनुक्रमण उपकरण घर में उपलब्ध नहीं हैं। अनुकूलित मिनी-बल्क प्रोटोकॉल लागत प्रभावी अनुक्रमण गहराई पर सूचना-समृद्ध जैविक संकेत प्रदान करता है, जिससे ज्ञात दवाओं और नए अणुओं की व्यापक जांच सक्षम होती है।
प्रयोग का उद्देश्य विभिन्न जैविक संदर्भों में पीबीएमसी पर दवा गतिविधि के लिए स्क्रीन करना है। इस प्रोटोकॉल को किसी भी जैविक प्रश्न पर लागू किया जा सकता है जहां कई दवाओं को एक ट्रांसक्रिप्टोमिक रीडआउट के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए, जिससे उपचार के सेलुलर प्रभाव का एक प्रतिलेख-विस्तृत दृश्य दिया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
दवा की खोज और दवा के विकास से सेलुलर प्रक्रियाओं के समग्र दृष्टिकोण से बहुत लाभ हो सकता है जो थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स प्रदान कर सकते हैं। फिर भी, यह दृष्टिकोण अक्सर मानक थोक आरएनए-सीक्यू प्रोटोकॉल के ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेएलएस जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति (EXC2151-390873048) के साथ-साथ एससीएचयू 950/8-1 के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा समर्थित है; जीआरके 2168, टीपी 11; CRC SFB 1454 मेटाफ्लेमेशन, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता परियोजना डाइट-बॉडी-ब्रेन (DietBB); और अनुदान संख्या 733100 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना SYSCID। एमबी डीएफजी (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) द्वारा समर्थित है। एलबी डीएफजी (इम्यूडाइट बीओ 6228/2-1 – प्रोजेक्ट नंबर 513977171) और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति (EXC2151-390873048) द्वारा समर्थित है। BioRender.com के साथ बनाई गई छवियां।
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Referências
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
