Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt fra ex vivo eller in vitro cellekulturer til transkriptomiske data forbehandling for kostnadseffektiv transkriptombasert legemiddelscreening.
Transkriptomikk gjør det mulig å få omfattende innsikt i cellulære programmer og deres respons på forstyrrelser. Til tross for en betydelig nedgang i kostnadene ved bibliotekproduksjon og sekvensering i det siste tiåret, er anvendelse av disse teknologiene i den skalaen som er nødvendig for narkotikascreening, fortsatt uoverkommelig dyrt, og hindrer det enorme potensialet i disse metodene. Vår studie presenterer et kostnadseffektivt system for transkriptombasert legemiddelscreening, som kombinerer miniatyriserte perturbasjonskulturer med mini-bulk transkriptomikk. Den optimaliserte minibulkprotokollen gir informative biologiske signaler ved kostnadseffektiv sekvenseringsdybde, noe som muliggjør omfattende screening av kjente legemidler og nye molekyler. Avhengig av valgt behandlings- og inkubasjonstid, vil denne protokollen resultere i sekvensering av biblioteker innen ca. 2 dager. På grunn av flere stopppunkter i denne protokollen kan bibliotekforberedelsen, samt sekvenseringen, utføres tidsuavhengig. Samtidig behandling av et høyt antall prøver er mulig; Måling av opptil 384 prøver ble testet uten tap av datakvalitet. Det er heller ingen kjente begrensninger i antall tilstander og/eller legemidler, til tross for at man vurderer variasjon i optimale inkubasjonstider.
Utviklingen av nye legemidler er en kompleks og tidkrevende prosess som innebærer å identifisere potensielle legemidler og deres mål, optimalisere og syntetisere legemiddelkandidater og teste deres effekt og sikkerhet i prekliniske og kliniske studier1. Tradisjonelle metoder for narkotikascreening, dvs. systematisk vurdering av biblioteker av kandidatforbindelser for terapeutiske formål, involverer bruk av dyremodeller eller cellebaserte analyser for å teste effektene på spesifikke mål eller veier. Selv om disse metodene har vært vellykkede i å identifisere legemiddelkandidater, ga de ofte ikke tilstrekkelig innsikt i de komplekse molekylære mekanismene som ligger til grunn for legemiddeleffektivitet og også toksisitet og mekanismer for potensielle bivirkninger.
Vurdering av genombrede transkripsjonstilstander presenterer en kraftig tilnærming for å overvinne nåværende begrensninger i narkotikascreening, da det muliggjør omfattende vurderinger av genuttrykk som respons på medikamentelle behandlinger2. Ved å måle RNA-transkripter på en genombred måte uttrykt på et gitt tidspunkt, har transkriptomikk som mål å gi et helhetlig syn på transkripsjonsendringene som oppstår som respons på legemidler, inkludert endringer i genuttrykksmønstre, alternativ spleising og ikke-kodende RNA-uttrykk3. Denne informasjonen kan brukes til å bestemme narkotikamål, forutsi legemiddeleffektivitet og toksisitet, og optimalisere doserings- og behandlingsregimer.
En av de viktigste fordelene ved å kombinere transkriptomikk med objektiv legemiddelscreening er potensialet til å identifisere nye legemiddelmål som ikke tidligere er vurdert. Konvensjonelle narkotikascreeningsmetoder fokuserer ofte på etablerte målmolekyler eller veier, hindrer identifisering av nye mål og potensielt resulterer i stoffer med uforutsette bivirkninger og begrenset effektivitet. Transkriptomikk kan overvinne disse begrensningene ved å gi innsikt i molekylære endringer som oppstår som respons på medikamentell behandling, avdekke potensielle mål eller veier som kanskje ikke tidligere har blitt vurdert2.
I tillegg til identifisering av nye legemiddelmål, kan transkriptomikk også brukes til å forutsi legemiddeleffekt og toksisitet. Ved å analysere genuttrykksmønstrene assosiert med legemiddelrespons, kan biomarkører utvikles som kan brukes til å forutsi pasientens respons på et bestemt legemiddel eller behandlingsregime. Dette kan også bidra til å optimalisere doseringen av legemidler og redusere risikoen for uønskede bivirkninger4.
Til tross for de potensielle fordelene, er kostnaden for transkriptomikk fortsatt en betydelig barriere for sin utbredte anvendelse i narkotikascreening. Transkriptomisk analyse krever spesialisert utstyr, teknisk ekspertise og dataanalyse, noe som kan gjøre det utfordrende for mindre forskerteam eller organisasjoner med begrenset finansiering å bruke transkriptomikk i legemiddelscreening. Imidlertid har kostnaden for transkriptomikk vært jevnt avtagende, noe som gjør den mer tilgjengelig for forskningsmiljøene. I tillegg har fremskritt innen teknologi og dataanalysemetoder gjort transkriptomikk mer effektiv og kostnadseffektiv, noe som ytterligere øker tilgjengeligheten2.
I denne protokollen beskriver vi et høydimensjonalt og eksplorativt system for transkriptombasert legemiddelscreening, som kombinerer miniatyriserte perturbasjonskulturer med mini-bulk transkriptomikkanalyse 5,6. Med denne protokollen er det mulig å redusere kostnaden per prøve til 1/6av dagens kostnad for kommersielle løsninger for full lengde mRNA-sekvensering. Protokollen krever bare standard laboratorieutstyr, det eneste unntaket er bruk av kortlest sekvenseringsteknologi, som kan outsources hvis sekvenseringsinstrumenter ikke er tilgjengelige internt. Den optimaliserte minibulkprotokollen gir informasjonsrike biologiske signaler ved kostnadseffektiv sekvenseringsdybde, noe som muliggjør omfattende screening av kjente legemidler og nye molekyler.
Målet med forsøket er å screene for legemiddelaktivitet på PBMC i ulike biologiske sammenhenger. Denne protokollen kan brukes på ethvert biologisk spørsmål der flere legemidler bør testes med en transkriptomisk avlesning, noe som gir et transkriptom-bredt syn på den cellulære effekten av behandlingen.
Narkotikaforskning og stoffutvikling kan ha stor nytte av det helhetlige synet på cellulære prosesser som bulktranskriptomikk kan gi. Likevel er denne tilnærmingen ofte begrenset av de høye kostnadene ved eksperimentet med standard bulk RNA-seq-protokoll, som forbyr anvendelsen i akademiske omgivelser, samt potensialet for industriell skalerbarhet.
De mest kritiske trinnene i protokollen er celletining og de første trinnene i bibliotekforberedelsen. Å sikre høy levedyktighet av cellene …
The authors have nothing to disclose.
J.L.S. støttes av German Research Foundation (DFG) under Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048), samt under SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, det BMBF-finansierte excellence-prosjektet Diet-Body-Brain (DietBB); og EU-prosjektet SYSCID under tilskuddsnummer 733100. M.B. støttes av DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. støttes av DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Prosjektnummer 513977171) og Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Bilder opprettet med BioRender.com.
50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |