Os efeitos anti-hipertensivos e mecanismos da decocção de Huotan Jiedu Tongluo em ratos com hipertensão tipo H

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipertensão do tipo H e avaliamos os efeitos anti-hipertensivos da decocção de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) administrada por via intragástrica. Em ratos com hipertensão do tipo H, o HTJDTLD teve efeitos anti-hipertensivos eficazes, possivelmente associados à inibição da ativação da via de apoptose induzida pelo estresse do retículo endoplasmático (ER).

Abstract

A hipertensão do tipo H, que é uma forma específica de hipertensão caracterizada por níveis elevados de homocisteína plasmática (Hcy), tornou-se um grande desafio de saúde pública em todo o mundo. Este estudo investigou os efeitos hipotensores e os mecanismos subjacentes da decocção Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), uma fórmula de medicina tradicional chinesa altamente eficaz comumente usada para tratar estenose vascular. A metionina foi usada para induzir hipertensão do tipo H em ratos, e o HTJDTLD foi administrado por via intragástrica. Em seguida, as pressões arteriais sistólica e diastólica da artéria caudal de ratos foram medidas por manometria caudal não invasiva de ratos. A avaliação histológica da aorta foi realizada pela coloração de hematoxilina-eosina (HE). O ensaio imunoenzimático (ELISA) foi usado para medir os níveis de Hcy, e a reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) e western blotting foram usados para determinar os níveis de mRNA e proteína da proteína reguladora de glicose 78 (GRP78), fator de necrose tumoral (TNF) fator associado ao receptor 2 (TRAF2), c-Jun N-terminal quinases (JNK) e caspase-3. Os resultados mostraram que o HTJDTLD reduziu significativamente a pressão arterial, aliviou as lesões histopatológicas e diminuiu os níveis de Hcy após o tratamento com metionina. Além disso, o HTJDTLD inibiu significativamente a expressão gênica e proteica de GRP78, JNK, TRAF2 e caspase 3, que estão envolvidos principalmente na via de apoptose induzida por estresse do retículo endoplasmático (ER). No geral, os resultados indicaram que o HTJDTLD teve efeitos anti-hipertensivos eficazes em ratos com hipertensão do tipo H e revelaram os mecanismos anti-hipertensivos associados à inibição da ativação da via de apoptose induzida pelo estresse do RE.

Introduction

A hipertensão, um importante fator de risco para ataque cardíaco, acidente vascular cerebral e insuficiência renal, tornou-se um importante desafio de saúde pública que afeta 1 bilhão de pessoas em todo o mundo¹. A homocisteína (Hcy), um aminoácido contendo grupo tiol, é um intermediário metabólico vital do metabolismo da metionina. A hipertensão com níveis plasmáticos elevados de Hcy é definida como hipertensão do tipo H, que pode ser um fator de risco significativo para a ocorrência e recorrência de doenças cardiocerebrovasculares, como o acidente vascular cerebral ^2,3. Estudos recentes têm relatado que a co-residência de hipertensão do tipo H poderia agravar os efeitos colaterais das doenças cardiovasculares e cerebrovasculares4. Notavelmente, 75% dos pacientes na China com hipertensão do tipo H têm hipertensão primária, o que afeta seriamente a qualidade de vida⁵. Atualmente, o tratamento da hipertensão do tipo H inclui principalmente a medicina ocidental. No entanto, pode causar certos efeitos adversos e baixa adesão e não pode mais atender às necessidades de tratamento abrangente da hipertensão do tipo H.

A medicina tradicional chinesa (MTC) é um recurso único com uma história de mais de 2.000 anos na China. Devido à necessidade não atendida de controle da hipertensão na medicina ocidental, os médicos começaram a considerar o papel potencial da MTC na prevenção e tratamento da hipertensão do tipo H⁶. Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD) é uma fórmula de medicina tradicional chinesa formulada pelo Professor Yue Deng, com base em sua extensa experiência clínica⁷. Ao longo de mais de 20 anos de aplicação clínica, o HTJDTLD demonstrou notável eficácia no tratamento de doenças cardiovasculares e cerebrovasculares¹. No entanto, não foi relatado se o HTJDTLD tem efeitos terapêuticos na hipertensão do tipo H. Portanto, nosso objetivo foi explorar os efeitos anti-hipertensivos e os mecanismos específicos do HTJDTLD em ratos com hipertensão do tipo H e identificar possíveis drogas terapêuticas para o tratamento da hipertensão do tipo H.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun. Os materiais estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais e tratamento

1. Divida aleatoriamente um total de 50 ratos adultos espontaneamente hipertensos (SHRs) (machos, 50 dias de idade) em cinco grupos, incluindo grupos controle (CON), metionina (MET), MET + HTJDTLD + maleato de enalapril (EM), MET + EM e MET + HTJDTLD.
   NOTA: Os ratos experimentais foram alojados em um ambiente controlado projetado para garantir seu conforto e bem-estar. A instalação apresentava salas com temperatura controlada a uma temperatura constante de 22 °C, com uma umidade relativa de 40-60%. As gaiolas de alojamento eram feitas de policarbonato transparente, proporcionando amplo espaço para cada rato se mover livremente. O cronograma de iluminação seguiu um ciclo claro/escuro de 12 horas, simulando condições naturais de luz do dia. Os ratos receberam comida e água adequadas.
2. Forneça aos ratos a seguinte dieta por 28 dias.
   1. Dê aos ratos do grupo MET uma dieta a 3% de metionina por 28 dias para induzir hipertensão do tipo H.
   2. Administrar os ratos do grupo MET + HTJDTLD + EM por via intragástrica com HTJDTLD (1,633 g/mL) e EM (0,2 mg/mL) na dose de 1 mL/kg quando os ratos além da dieta a 3% de metionina.
   3. Administrar os ratos dos grupos MET + EM e MET + HTJDTLD com HTJDTLD ou EM por gavagem, respectivamente, além da dieta com 3% de metionina.
      NOTA: O HTJDTLD consiste em Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) e Radix Scrophulariae (15 g), e foi decoctado conforme relatado anteriormente⁷. O EM dissolvido em água purificada (0,2 mg/mL) serviu como controle positivo.

2. Medição da pressão arterial

NOTA: As medições da pressão arterial são realizadas usando um esfigmomanômetro não invasivo (Tabela de Materiais).

1. Após o tratamento por 28 dias, jejuar os ratos de cada grupo por 12 h e medir a pressão arterial.
2. Escolha um dispositivo de retenção que corresponda ao tamanho do rato. O dispositivo de contenção utilizado neste estudo é composto por uma tela de contenção cilíndrica, cobertura de lona, tubo térmico e almofada de espuma estabilizadora. Coloque o rato na malha de contenção, coloque a malha de contenção no tubo térmico e, em seguida, coloque o tubo térmico na cobertura de lona.
3. Coloque o cabo de sinal em uma posição adequada sob a tampa. Coloque a cauda do rato na abertura fornecida na tampa e prenda-a na almofada estabilizadora. Um ambiente desocupado, silencioso e quente é preferido para medições. Mova os ratos para o local de medição com 20-30 minutos de antecedência para que os ratos possam se adaptar ao ambiente de medição.
   NOTA: As etapas 2.2-2.3 podem ser executadas várias vezes para estabilizar os ratos. Após várias sessões de treinamento, os ratos se acostumarão e poderão se estabilizar muito rapidamente, o que é conveniente para a medição subsequente da pressão arterial.
4. Conecte a conexão da mangueira de ar do sensor pressurizado, a conexão de sinal e o tubo de retenção. Coloque o sensor de pressurização na ponta da cauda.
5. Meça a pressão arterial. Uma onda de pulso aparece depois que a cauda do rato é inserida no sensor. Pressione Iniciar/Parar para iniciar/parar a medição.
   NOTA: O dispositivo determinará automaticamente se a cauda do rato está inserida no sensor. Quando a cauda do rato não é inserida, o sensor de pressurização não inicia a pressurização e não faz a medição.
6. Quando o teste de pressão arterial for concluído, o menu Resultado aparecerá automaticamente. Verifique o valor médio da medição, desvio padrão (DP), erro padrão (SE) e coeficiente de variação (CV) no menu Resultados .
   NOTA: A pressão arterial de cada rato foi aferida três vezes, com intervalo superior a 2 min, e o valor médio foi calculado.
7. Após medir a pressão arterial, eutanasiar o rato por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 2% em excesso (100 mg / kg). Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça dentada, disseque o rato camada por camada, do períneo ao pescoço. Vire o conteúdo torácico e abdominal, navegue até a bifurcação da aorta abdominal entre os dois rins e colete a aorta até uma seção do arco aórtico.

3. Coloração de hematoxilina-eosina (HE)

1. Fixe o tecido vascular aórtico em paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h.
2. Pegue as amostras vasculares, desidrate-as em álcool gradiente, torne-as transparentes em xileno e incorpore-as em parafina.
3. Após a incorporação, faça fatias contínuas com 3-5 mm de espessura. Seque as fatias a 60-70 °C e guarde-as à temperatura ambiente (RT).
4. Desparafine as seções imergindo-as em xileno I por 30 min, xileno II por 30 min, álcool 100% I por 10 min, álcool 100% II por 10 min, álcool 95% I por 5 min, álcool 95% II por 5 min, álcool 80% por 5 min e, em seguida, enxágue com água destilada.
5. Pinte as seções com hematoxilina Harris por 5 min e enxágue em água da torneira por 5 min. Diferencie em álcool de ácido clorídrico a 1% por 10 s e enxágue abundantemente em água da torneira por 15 min. Lave a seção em água com amônia por 5 s e enxágue abundantemente em água da torneira por 15 min.
6. Faça observação microscópica, core com eosina por 10 min e enxágue abundantemente em água da torneira por 15 min.
7. Desidrate as seções mergulhando-as em álcool etílico 80% por 10 s, álcool 95% I por 5 min, álcool 95% II por 5 min, álcool 100% I por 10 min, álcool 100% II por 10 min, xileno I por 10 min e xileno II por 10 min.
8. Sele as seções usando goma neutra.
9. Observe as alterações histológicas nos tecidos da aorta sob um microscópio óptico (objetiva de 100x, aumento de 1000x).

4. Coloração tricrômica de Masson

1. Realize a desparafinação de rotina semelhante à coloração HE.
2. Coloração de hematoxilina: Mergulhe as lâminas em solução de hematoxilina por 10 min e depois enxágue com água da torneira imediatamente.
3. Mergulhe as lâminas em solução de ácido clorídrico a 1% por alguns segundos e depois enxágue com água da torneira imediatamente depois.
4. Mergulhe as lâminas na mancha magenta ácida de Lichtenstein por 5 min e depois enxágue com água.
5. Mergulhe as lâminas em ácido fosfomolíbdico a 1% por 5 min.
6. Mergulhe as lâminas em uma coloração azul de anilina a 2% por 5 min e uma solução de lavagem por imersão em ácido acético glacial a 1% por 1 min. Em seguida, lave as lâminas rapidamente em álcool a 95% 3 vezes.
7. Realize desidratação de rotina, transparência e vedação de gengiva neutra semelhante à coloração HE.

5. Medição de Hcy por ELISA

1. Anestesiar os ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 2% (45 mg/kg) e confirmar a profundidade da anestesia por uma pinça no dedo do pé. Segure o rato e corte os bigodes para evitar o contato ao tirar sangue. Remova os globos oculares do rato com uma pinça curva e colete o sangue nos tubos de microcentrífuga estéreis preparados. Em seguida, eutanasiar o rato com uma injeção intraperitoneal de excesso de pentobarbital sódico a 2% (100 mg / kg).
2. Deixe o sangue coagular naturalmente por 10-20 min em RT e, em seguida, centrifugue (626-1409 x g) o sangue por cerca de 20 min a 2-8 ° C.
3. Recolher cuidadosamente o sobrenadante e guardá-lo no frigorífico a -80 °C.
4. Dilua o padrão no tubo de ensaio de acordo com as instruções do kit.
5. Configure os poços em branco (nenhuma amostra e reagentes enzimáticos são adicionados aos poços de controle em branco; o restante das etapas é o mesmo), poços padrão e poços de amostra a serem testados. Adicione 50 μL de padrões na placa, 40 μL de solução de diluição de amostra nos poços de amostra e, em seguida, 10 μL de soro (a diluição final da amostra é 5 vezes).
   NOTA: Adicione a amostra ao fundo dos poços da placa; Tente não tocar nas paredes dos poços e agite suavemente para misturar.
6. Selar a placa com película de vedação e incubar a 37 °C durante 30 min.
7. Diluir a solução de lavagem concentrada 30 vezes 30 vezes com água destilada e preparar para o uso.
8. Remova o filme de vedação com cuidado, descarte o líquido e agite-o para remover todo o líquido. Encha cada poço com solução de lavagem, deixe por 30 s e descarte. Repita isso 5 vezes e seque.
9. Adicione 50 μL de reagente enzimático a cada poço, exceto os poços em branco.
10. Use um filme de vedação para selar a placa e, em seguida, incube a 37 °C por 30 min.
11. Repita a etapa 5.8.
12. Adicione 50 μL de revelador de cor A a cada poço, em seguida, adicione 50 μL de revelador de cor B e agite suavemente para misturar bem. Incubar a 37 °C durante 10 min em condições de pouca luz.
13. Adicione 50 μL da solução de parada a cada poço para encerrar a reação (a cor azul ficará amarela).
14. Zero a reação com poços em branco e medir a absorbância (valor OD) de cada poço sequencialmente a 450 nm.
    NOTA: A medição deve ser realizada dentro de 15 minutos após a adição da solução de parada.

6. Extração de RNA e RT-PCR quantitativo

1. Extraia o RNA total.
   1. Corte o tecido aórtico fresco rapidamente no tamanho apropriado (30-50 mg / peça) e triture bem em nitrogênio líquido. Adicione 1 mL de reagente Trizol, misture bem e incube no gelo por 10 min para lisar o tecido.
   2. Centrifugar a 2250 x g durante 10 min a 4 °C. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga sem pellets.
   3. Adicione 200 μL de clorofórmio, agite vigorosamente por 15 s e incube em RT por 5 min.
   4. Centrifugar a 2250 x g durante 15 min a 4 °C. A mistura será dividida em três camadas: a fase orgânica inferior fenol-clorofórmio, a fase intermediária e a fase aquosa superior.
   5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga (cerca de 60% do volume de Trizol). Não aspirar a fase intermédia; uma pequena quantidade de líquido superior pode ser deixada.
   6. Adicione um volume igual de isopropanol, misture delicadamente invertendo cerca de 10 vezes e deixe por 10 min em RT.
   7. Centrifugar a 2250 x g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e lavar o precipitado de ARN duas vezes com 1 ml de etanol a 75%.
   8. Centrifugue a 2250 x g por 5 min a 4 °C, descarte o sobrenadante e seque ao ar em RT por 5-10 min.
   9. Dissolva o RNA em 15-50 μL de água de dietilpirocarbonato (DEPC) e verifique a concentração de RNA.
2. Realizar transcrição reversa e RT-qPCR (Tabela 1)
   1. Detectar a expressão gênica relacionada ao estresse do retículo endoplasmático (ERS) e apoptose por qRT-PCR. Use o RNA total extraído na etapa 6.1 e transcreva-o reversamente para cDNA usando o kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Determine a expressão gênica usando um sistema de detecção de PCR em tempo real com uma mistura mestre de PCR SYBR Green em um volume de reação de 20 μL.
   3. Analise quantitativamente os dados pelo método 2^−ΔΔCTe expresse-os como uma diferença de n vezes em relação à expressão de β-actina. Os primers são mostrados na Tabela 2.

7. Western blotting (WB)

1. Extraia a proteína total do tecido.
   1. Coloque uma pequena quantidade de bloco de tecido na parte esférica do homogeneizador de 1-2 mL e corte o bloco de tecido o máximo possível com uma tesoura limpa.
   2. Adicione 400 μL (w:v=1:10) do tampão de lise RIPA e homogeneize. Em seguida, coloque-o no gelo. Após alguns minutos, moa novamente e coloque no gelo. Repita o processo de moagem várias vezes.
   3. Após 30 minutos de lise, use uma pipeta para transferir o lisado para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e coloque o tubo em uma centrífuga pré-resfriada a 4 ° C. Centrifugue a 2250 x g por 10 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
2. Quantifique a proteína.
   1. Dilua os padrões de proteína de acordo com as instruções do kit. Obtenha gradientes de padrões da seguinte forma: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 e 2000 ng/μL.
   2. Pegue 2,5 μL da amostra de proteína e dilua-a para 25 μL (10 vezes) usando o diluente de amostra.
   3. Pegue uma placa de 96 poços e adicione 20 μL de amostra de proteína padrão (de acordo com o gradiente de concentração) e proteína alvo aos poços, respectivamente - dois poços para cada amostra de proteína alvo.
   4. Prepare a solução de revelação (pronta para uso) misturando o líquido A e o líquido B na proporção de 50:1 e adicione 200 μL de solução de revelação a cada poço.
   5. Coloque a placa de 96 poços com amostras adicionadas em uma incubadora a 37 °C por 30 min.
   6. Detectar a absorvância a 562 nm.
   7. Calcular a concentração de proteínas a medir.
      1. Tome a concentração de proteína padrão como a coordenada vertical e a absorbância a 562 nm como a coordenada horizontal para desenhar a curva padrão.
      2. Calcular a concentração da proteína-alvo com base na fórmula obtida a partir da curva-padrão e da absorvância medida da proteína-alvo.
   8. Adicione 180 μL de tampão de carga a 20 μL de amostra de proteína em um tubo de microcentrífuga. Coloque o tubo da centrífuga em um banho de metal e desnature a 100 °C por 10 min. Utilizar a proteína WB desnaturada ou conservá-la a -20 °C.
3. Realize immunoblotting.
   1. Configure o gel de eletroforese de proteínas.
      1. Limpe e seque a placa de vidro de fundição em gel (1 mm ou 1.5 mm) e fixe-a no dispositivo de fundição em gel.
      2. Prepare o gel de separação a 10% de acordo com a Tabela 3. Adicione o gel de separação configurado entre as placas de vidro. Adicione a solução de gel lentamente para evitar a produção de bolhas de ar. Em seguida, adicione uma quantidade adequada de etanol anidro para achatar a superfície líquida do separador. Deixe em RT por 20-30 min até que o gel esteja solidificado.
         NOTA: Quanto maior o peso molecular, menor a concentração de cola, de acordo com a necessidade de formular outras concentrações de cola separadora.
      3. Prepare o gel concentrado a 5% de acordo com a Tabela 3. Após a solidificação do gel de separação, despeje a camada superior de etanol anidro, encha o gel concentrado e insira lentamente o pente de gel que combina com a placa de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Deixe em RT por 20-30 min para que o gel concentrado solidifique.
   2. Realize eletroforese.
      1. Pese 60,5 g de Tris, 375 g de glicina e 20 g de dodecil sulfato de sódio (SDS). Adicione água a 2 L, aqueça a 60 °C e mexa para dissolver para formar uma solução de eletroforese 10x. Deixe a solução estar em RT; dilua para 1x quando usado.
      2. Remova a placa de vidro contendo cola do dispositivo de fundição em gel, puxe para baixo o pente de cola no fluxo de água a uma velocidade uniforme e, ao mesmo tempo, drene as bolhas de ar no orifício de amostragem.
      3. Fixe a placa de vidro no tanque de eletroforese e adicione a solução de eletroforese 1x configurada. Certifique-se de que o tanque interno esteja cheio e que o tanque externo seja metade do tanque interno.
      4. Adicione a mesma massa de amostra de proteína e 5 μL de marcador (usado para indicar o tamanho da proteína) no poço de adição da amostra.
      5. Execute o gel a 60 V por 20 min, depois a 100 V por 90 min até que o buffer de carga vá para o fundo.
   3. Execute a transferência de membrana.
      1. Pese 60 g de Tris e 288 g de glicina e adicione água a 2 L. Mexa e dissolva bem a solução para fazer 10x solução de transferência de membrana e reserve em RT. Dilua na proporção de 1:2:7 (10x solução transmembrana: metanol: água) para fazer 1x solução de trabalho.
         NOTA: A solução transmembrana deve ser preparada com antecedência e resfriada a 4 ° C na geladeira.
      2. Mergulhe o PVDF em metanol por um período de tempo apropriado (0,5-1 min) para ativar os grupos carregados positivamente na membrana e facilitar a ligação com proteínas carregadas negativamente.
      3. Pegue o clipe de transferência de membrana e fixe-o depois de colocar os componentes em ordem (superfície preta-esponja-filtro de papel-gel de eletroforese-PVDF membrana-filtro de papel-esponja-superfície branca em sequência).
         NOTA: Tenha cuidado para evitar bolhas de ar; Quando houver bolhas de ar, use o rolo para expulsar as bolhas de ar.
      4. Coloque a tala no tanque de transferência de membrana, preste atenção em seguir o posicionamento correto do eletrodo, coloque dois sacos de gelo no tanque e encha com 1x líquido de transferência de membrana. Por fim, coloque todo o tanque transmembrana no gelo.
      5. Defina as condições de transferência da membrana para 100 V por 1 h.
         NOTA: O tempo de transferência da membrana pode ser ajustado de acordo com o tamanho da proteína; Quanto menor o peso molecular da proteína, menor o tempo de transferência da membrana.
   4. Execute o bloqueio.
      1. Para proteínas fosforiladas, use 5% de BSA (solvente TBST) como solução de bloqueio. Para proteínas não fosforiladas, use 5% de leite desnatado (solvente TBST) para bloqueio.
      2. Despeje a solução de bloqueio em um prato de tamanho apropriado. Coloque a membrana de PVDF no prato e certifique-se de que a membrana de PVDF esteja submersa na solução de bloqueio. Feche o prato e incube em RT por 1 h.
      3. Remova a membrana. De acordo com a exibição do marcador e o tamanho de cada proteína-alvo, corte a membrana no tamanho apropriado e etiquete-a com os números de série.
   5. Incubar o anticorpo
      1. Remova a solução de bloqueio e absorva o líquido residual com papel de filtro. Coloque o PVDF cortado correspondente nas diluições de anticorpos correspondentes (incluindo CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], caspase [1:1000] e GAPDH [1:1000]) e coloque-o no agitador rotativo a 4 °C durante a noite.
      2. Adicione 1x TBST e enxágue em RT três vezes (10 min cada).
      3. Incubar a membrana de PVDF nas diluições de anticorpos secundários de acordo com as instruções do fabricante e incubar em RT durante 1 h.
      4. Enxágue a membrana adicionando 1x TBST em RT três vezes (10 min cada).
   6. Desenvolva a membrana de PVDF.
      1. Misture volumes iguais de líquido A e líquido B no kit de solução luminescente, agite bem e prepare para uso.
      2. Coloque a membrana de PVDF no filme plástico para espalhar e adicione rápida e uniformemente o agente luminescente preparado na membrana de forma rápida e uniforme. Incubar durante 3 min à temperatura de saída, evitando a luz.
      3. Detecte as bandas de proteínas usando reagentes de detecção de western blotting de quimioluminescência aprimorada (ECL).

8. Análise dos dados

1. Expresse todos os dados como a média ± S.D. Realize análises estatísticas por ANOVA unidirecional usando o software SPSS 20.0. Considere-se as diferenças estatisticamente significativas quando p < 0,05.

Results

Conforme mostrado na Tabela 4 e na Tabela 5, a pressão arterial sistólica (PAS) e a pressão arterial diastólica (PAD) foram significativamente maiores no grupo MET do que no grupo CON de 1 a 4 semanas. Após o tratamento com HTJDTLD, a PAS e a PAD dos ratos foram significativamente menores do que as do grupo MET. Notavelmente, a utilização combinada de HTJDTLD e EM teve um efeito anti-hipertensivo mais forte do que o tratamento com HTJDTLD sozinho.

De acordo com a coloração HE e a coloração tricrômica de Masson, o endométrio da parede do vaso aórtico estava incompleto e não liso, e a média estava significativamente espessada. Houve proliferação e hipertrofia de células musculares lisas, o número de camadas de arranjo aumentou e as fibras foram desordenadas no grupo MET em comparação com as do grupo CON. No entanto, o endométrio vascular recuperou-se de forma mais completa e suave, o espessamento médio foi significativamente reduzido e o dano intimal nos grupos MET + HTJDTLD + EM, MET + EM e MET + HTJDTLD foi significativamente aliviado (Figura 1 e Figura 2). Além disso, a concentração de Hcy no grupo metionina foi 2 vezes maior do que no grupo controle. No entanto, as concentrações de Hcy nos grupos MET + HTJDTLD + EM, MET + EM e MET + HTJDTLD foram significativamente menores do que as do grupo MET. Notavelmente, a redução mais significativa foi encontrada no grupo MET + HTJDTLD + EM, que foi aproximadamente 1 vez menor do que no grupo MET (Figura 3). Os resultados da expressão de mRNA e proteína mostraram que a expressão de GPR78, TRAF2, JNK, p-JNK e caspase-3 foi obviamente regulada positivamente após o tratamento com metionina. No entanto, HTJDTLD, EM e a combinação de HTJDTLD e EM inibiram significativamente a regulação positiva de GPR78, TRAF2, JNK e caspase-3. Notavelmente, a aplicação combinada de HTJDTLD e EM teve o efeito mais significativo (Figura 4 e Figura 5).

Figura 1: Coloração HE. Alterações histológicas dos tecidos da aorta torácica de (A) grupo CON, (B) grupo MET, (C) grupo MET + HTJDTLD + EM, (D) grupo MET + EM e (E) grupo MET + HTJDTLD. Os núcleos são corados de azul, enquanto o citoplasma e a matriz extracelular têm graus variados de coloração rosa (100x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Coloração de Masson. (A) Grupo CON, (B) Grupo MET, (C) Grupo MET + HTJDTLD + Grupo EM, (D) Grupo MET + EM e (E) Grupo MET + HTJDTLD. A coloração de Masson dos vasos aórticos em cada grupo foi realizada para avaliar o efeito do HTJDTLD na deposição e fibrose (100x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O nível de Hcy. A concentração sérica de Hcy de cada grupo foi detectada por ELISA. Os dados foram apresentados como DP médio ± (n = 6, DP são os seguintes: CON: 236,5 nmol/L, MET: 185 nmol/L, MET + HTJDTLD + EM: 126,8 nmol/L, MET + EM: 124 nmol/L, MET + HTJDTLD: 325 nmol/L). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A expressão de mRNA de GRP78, TRAF2, JNK e caspase-3. Após o tratamento com MET, MET + EM + HTJDTLD e MET + EM, a expressão de genes relacionados à ERS foi detectada por qRT-PCR. Os dados foram apresentados como média ± DP (n = 6, DP da seguinte forma: GRP78 [CON: 0,12, MET: 0,13, MET + HTJDTLD + EM: 0,11, MET + EM: 0,17, MET + HTJDTLD: 0,12]; TRAF2 [CON: 0,09, MET: 0,09, MET + HTJDTLD + EM: 0,07, MET + EM: 0,11, MET + HTJDTLD: 0,13]; JNK [CON: 0,99, MET: 0,01, MET + HTJDTLD + EM: 0,03, MET + EM: 0,06, MET + HTJDTLD: 0,07; caspase-8 [CON: 0,06, MET: 0,10, MET + HTJDTLD + EM: 0,01, MET + EM: 0,13, MET + HTJDTLD: 0,03). * representa uma diferença significativa em comparação com o grupo CON, # representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET, Δ representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET + HTJDTLD, e ∇ representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET + EM. p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A expressão proteica de GRP78, TRAF2, JNK, p-JNK e Caspase-3. (A) As amostras de proteína foram analisadas por western blotting com anticorpos GRP78, TRAF2, JNK, p-JNK e Caspase-3. O GAPDH foi usado como controle. (B) A quantificação das proteínas GRP78, RAF2, JNK, p-JNK e Caspase-3 foi determinada por densitometria e foi normalizada para GAPDH. Os dados foram apresentados como média ± DP (n = 6). * representa uma diferença significativa em relação ao grupo CON, p < 0,01. # representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET, Δ representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET + HTJDTLD e ∇ representa uma diferença significativa em comparação com o grupo MET + EM. p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reação de transcrição reversa
Componente	Volume (mL)
Total RNA	2
Mistura de digestor de gDNA	3
SuperMix plus	5
Água sem RNase	10
O programa de reação foi o seguinte: 25 °C, 5 min; 55 °C, 15 min; 85 °C, 5 min.
RT-PCR
Componente	Volume (mL)
Modelo	2
Primer direto (10μM)	0.4
Primer reverso (10μM)	0.4
Mistura verde de qPCR	10
Água livre de nuclease	7.2
O programa de reação foi o seguinte: pré-desnaturação 95 °C, 5 min; desnaturação 95 °C, 10 s; recozimento/extensão 60 °C, 45 s, para um total de 40 ciclos.

Tabela 1: Volumes de reação de transcrição reversa.

Nome do primer	Sequência (5' a 3')
GPR78-F	CGTCGTATGTGGCCTTCACT
GPR78-R	ATTCCAAGTGCGTCCGATGA
TRAF2-F	GAAGGGAGCATTCCTAGACC
TRAF2-R	GAAGGGAGCATTCCTAGACC
JNK-F	GTCAGAATCCGAACGAGA
JNK-R	GTCTACGCAGGCAATCG
Caspase-3-F	GCGGTATTGAGACAGACAGTGGAAC
Caspase-3-R	GCGGTAGAGTAAGCATACAGGAAGTC

Tabela 2: Lista de primers.

Gel de separação a 10%, sistema de 5 mL:
Componente	Volume (mL)
H2O	1.9
30% de acrilamida	1.7
1,5 mol/L Tris-HCL (pH 8,8)	1.3
10% SDS	0.05
10% de persulfato de amônio	0.05
TEMED	0.002
Gel concentrado a 5%, sistema de 3 mL:
Componente	Volume (mL)
H2O	2.1
30% de acrilamida	0.5
1,0 mol/L Tris-HCL (pH 6,8)	0.38
10% SDS	0.03
10% de persulfato de amônio	0.03
TEMED	0.003

Tabela 3: Composição da separação e do gel concentrado.

Grupo	1 semana	2 semanas	3 semanas	4 semanas
CON	163,4 ± 6	150,1 ± 7,0	134,2 ± 9,9	158,8 ± 10,2
CONHECI	192,1 ± 9,5##	166,7 ± 12,8#	177,3 ± 19,7##	187 ± 23.6##
MET+HTJDTLD+EM	165,4 ± 9,2##	148,9 ± 11,1*	134,5 ± 12,3**	159,2 ± 19,6**
EM + EM	173 ± 9.1##	149,9 ± 18,7*	145 ± 12,5**	162,4 ± 19,1**
MET+HTJDTLD	176,7 ± 8,4##	154,9 ± 22,8	168,3 ± 10,2	172,2 ± 17,4

Tabela 4: As mudanças na pressão sistólica. ^#p < 0,05 e ^##p < 0,01 vs. grupo controle, *p <0,05 e **p < 0,01 vs. grupo MET.

Grupo	1 semana	2 semanas	3 semanas	4 semanas
CON	138,4 ± 13,8	121,2 ± 12,5	107 ± 19,7	131,1 ± 16,3
CONHECI	147,9 ± 7,7#	131 ± 11,9	143,7 ± 19,6##	146 ± 21.4##
MET+HTJDTLD+EM	139,4 ± 10	123,1 ± 18,5	117,1 ± 9,6**	129,2 ± 18,6**
EM + EM	140,9 ± 13,4	119,6 ± 7,8	123,6 ± 10,8**	128 ± 25,2**
MET+HTJDTLD	140,4 ± 11,3	129,5 ± 11,1	138,3 ± 15,1	132.8 ± 16

Tabela 5: As mudanças na pressão diastólica.^#p < 0,05 e ^##p < 0,01 vs. grupo controle, **p < 0,01 vs. grupo MET.

Discussion

A hipertensão é um dos distúrbios cardiovasculares mais comuns que afeta um terço da população adulta e aumenta o risco de acidente vascular cerebral, doença cardíaca coronária e insuficiência cardíaca e renal⁸. A hipertensão do tipo H é um tipo especial de hipertensão que se refere à co-ocorrência de hipertensão primária e aumento dos níveis de homocisteína e tem atraído ampla atenção ao longo dos anos⁹. Nos últimos anos, o uso de EM oral combinado com medicamentos anti-hipertensivos mostrou maior eficácia em termos de controle da pressão arterial e redução dos níveis de Hcy no sangue, mas ainda existem muitas contra-indicações, efeitos colaterais, resistência a medicamentos e outras deficiências, como dor de cabeça, tontura, fadiga, tosse e hipotensão. A medicina tradicional chinesa oferece vantagens no tratamento da hipertensão do tipo H por meio de sua abordagem personalizada, abordando as causas subjacentes e fornecendo efeitos complementares com menos efeitos colaterais, permitindo o gerenciamento eficaz a longo prazo da condição. Neste estudo, descobrimos que a fórmula da medicina tradicional chinesa HTJDTLD teve obviamente efeitos anti-hipertensivos na hipertensão do tipo H induzida por metionina. Mais importante, o HTJDTLD aumentou significativamente a eficácia anti-hipertensiva do EM, que é o primeiro tratamento aprovado para hipertensão associada a Hcy elevada. No entanto, a administração de EM às vezes produz algumas reações adversas.

O nível de Hcy, um aminoácido contendo enxofre formado durante o metabolismo da metionina, é elevado em doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, incluindo hipertensão¹⁰, doença de Alzheimer, demência¹¹ e doença de Parkinson¹². Um estudo anterior também indicou que a interação entre hipertensão e homocisteína afeta o risco de mortalidade entre indivíduos de meia-idade e idosos¹³. Woo et ^al.14 relataram que níveis aumentados de Hcy causam disfunção endotelial e estão associados à rigidez arterial, que é resultado da destruição das fibras de elastina e aumento da produção de colágeno. Neste estudo, descobrimos que o nível de Hcy no plasma foi significativamente aumentado no grupo de tratamento com metionina, o que também foi combinado com pressão arterial elevada e alterações patológicas arteriais significativas. No entanto, o tratamento com HTJDTLD reduziu significativamente a pressão arterial, aliviou o dano arterial patológico e reduziu os níveis de Hcy. EM, uma nova preparação composta contendo enalapril e ácido fólico, serviu como o primeiro tratamento aprovado para hipertensão associada a Hcy¹⁵ elevada. Vale ressaltar que o HTJDTLD aumentou os efeitos anti-hipertensivos, conforme indicado pela diminuição dos níveis de Hcy e alívio de alterações patológicas.

O retículo endoplasmático (RE) é a organela central para a síntese, dobramento e modificação de proteínas secretadas e transmembranares¹⁶. A perturbação da função normal do RE pode levar ao estresse do RE, que tem sido associado a muitas doenças e, mais recentemente, à hipertensão^17,18. Além disso, relatórios anteriores indicaram que a Hcy pode ativar o estresse do RE, interrompendo a formação de ligações dissulfeto e reduzindo a viabilidade endotelial e o vasorelaxamento¹⁹. O estresse do RE induzido por Hcy também pode causar apoptose endotelial^20,21. No entanto, se o HTJDTLD exerce efeitos anti-hipertensivos regulando o estresse do RE não foi estudado. Portanto, exploramos os efeitos anti-hipertensivos do HTJDTLD por meio da via de apoptose induzida por estresse do RE. O GPR78, também conhecido como Bip, é um acompanhante importante e é ativado após o estresse do RE²². O fator 2 associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF2) também provou estar associado a respostas celulares a sinais intrínsecos, como o estresse do RE²³. O TRAF2 inicia cascatas de transdução de sinal, levando à ativação da quinase N-terminal c-Jun (JNK) de maneira dependente da célula e do contexto²⁴. A caspase-3, um executor crucial da apoptose, desempenha um papel fundamental no processo apoptótico e pode ser ativada por várias vias em vários tipos de células de mamíferos²⁵. A caspase-3, um executor crucial da apoptose, desempenha um papel fundamental no processo apoptótico e pode ser ativada por várias vias em vários tipos de células de mamíferos²⁶. A caspase-3 está envolvida na apoptose mediada por estresse do RE e serve como o membro comum final de diferentes cascatas apoptóticas²⁷. Neste estudo, detectamos a expressão gênica e proteica de GPR78, TRAF2, JNK e caspase 3 por qRT-PCR e western blotting. Os resultados mostraram que o tratamento com metionina aumentou significativamente a expressão gênica e proteica de GPR78, TRAF2, JNK e caspase 3, e o HTJDTLD inibiu significativamente a expressão desses genes e proteínas. No entanto, ainda existem algumas limitações para usar apenas esses dois métodos. Pode ser ideal avaliar o mecanismo de ação do HTJDTLD usando o inibidor da via de sinal relacionada ao ERS e detectando a apoptose celular por citometria de fluxo. Continuaremos a melhorar nosso protocolo experimental em estudos futuros.

Nossos resultados indicaram que o HTJDTLD teve efeitos anti-hipertensivos em ratos com hipertensão do tipo H induzida por metionina. O mecanismo subjacente pode envolver a inibição da apoptose induzida pela ativação do estresse do RE. Devido aos seus efeitos anti-hipertensivos e mecanismo potencial em ratos com hipertensão induzida por metionina, o HTJDTLD é uma grande promessa para futuras aplicações terapêuticas no tratamento da hipertensão.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ª Fita de Síntese de cDNA SuperMix para qPCR	Yeasen, China	11149ES	kit de síntese de cDNA
Anticorpo anti-beta-actina	Bioss, China	bs-0061R
Anticorpo anti-caspase-3	Bioss, China	bs-0081R
Anticorpo anti-GPR78	Abcam, EUA	ab108513
Anticorpo anti-JNK	Abcam, EUA	ab76572
Anticorpo anti-p-JNK	Bioss, China	bsm-52462R
Anticorpo IgG anti-coelho	Bioss, China	bs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 anticorpo	Bioss, China	bs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system	Sistema de detecção de PCR em tempo real	Bio-Rad	CFX96
Substratos de Western Blot ECL	Merck, MA, EUA	WBULP-10ML
Comprimidos de ácido fólico de maleato de enalapril	Yangzijiang Pharmaceutical Company, China	20040991
FastStart SYBR Green Master	Sigma	FSSGMMRO
Fructus Trichosanthis	O primeiro hospital afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número de catálogo
Hirudo	O Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número de
esfigmomanômetro inteligente não invasivo	Beijing Softron Biotechnology company	BP-2010A
Lonicerae Japonicae Flos	O primeiro hospital afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Metionina	Sigma, EUA	M9500
Radix Angelicae Sinensis	O primeiro hospital afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número de catálogo
Radix et Rhizoma Glycyrrhizae	O primeiro hospital afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Radix et Rhizoma Nardostachyos	O primeiro hospital afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Radix et Rhizoma Rhodiolae Crenulatae	O Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae	O Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Radix Scrophulariae	O Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun, China	Sem número
Kits de ELISA de rato Hcy Shanghai	Meimian Industrial Company, China	MM-0293R2
RIPA buffer	Shanghai Beyotime Biotechnology company	P0013B