תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים
Summary
המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.
Abstract
יתושים הם וקטורים יעילים של מחלות קטלניות ויכולים לנווט בסביבתם הכימית באמצעות קולטנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח שלהם. הבנת האופן שבו קולטנים כימו-סנסוריים מאורגנים מרחבית בתוספות הריח ההיקפיות יכולה להציע תובנות לגבי האופן שבו ריח מקודד במערכת חוש הריח של יתושים ולספק דרכים חדשות להילחם בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים. הופעתה של תגובת שרשרת הכלאה מהדור השלישי RNA פלואורסצנטי באתרו (HCR RNA, WM-FISH) מאפשרת מיפוי מרחבי ופרופיל ביטוי סימולטני של גנים כימו-סנסוריים מרובים. כאן, אנו מתארים גישה מדורגת לביצוע HCR RNA WM-FISH על אנטנת יתוש אנופלס ומישוש מקסילרי. חקרנו את הרגישות של טכניקה זו על ידי בחינת פרופיל הביטוי של קולטני ריח יונוטרופיים. שאלנו אם טכניקת HCR WM-FISH שתוארה מתאימה למחקרים מרובים על ידי קשירת גשושיות RNA לשלושה פלואורופורים מובחנים ספקטרלית. התוצאות סיפקו ראיות לכך ש- HCR RNA WM-FISH רגיש מאוד לזיהוי בו זמנית של גנים כימו-סנסוריים מרובים באנטנה ובתוספות הריח של מישוש הריח המקסילרי. חקירות נוספות מעידות על התאמתו של HCR WM-FISH לפרופיל ביטוי משותף של מטרות RNA כפולות ומשולשות. טכניקה זו, כאשר מיושמת עם שינויים, יכולה להיות ניתנת להתאמה כדי למקם גנים בעלי עניין ברקמות הריח של מיני חרקים אחרים או בנספחים אחרים.
Introduction
וקטורים של יתושים כגון אנופלס גמביה מסתמכים על רפרטואר עשיר של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח ההיקפיות שלהם כדי לשגשג בעולם כימי מורכב ולזהות ריחות רלוונטיים התנהגותית הנובעים מפונדקאים אנושיים, לאתר מקורות צוף ולאתר אתרי אוביפוזיציה1. אנטנת היתוש והמישוש המקסילרי מועשרים בגנים כימו-סנסוריים המניעים זיהוי ריחות בתוספות חוש הריח הללו. שלוש קבוצות עיקריות של תעלות יונים מגודרות ליגנד מניעות זיהוי ריחות בתוספות הריח של יתושים: קולטני הריח (ORs), הפועלים עם קולטן אובלנטי אובלנטי (Orco); קולטנים יונוטרופיים (IRs), אשר אינטראקציה עם קולטן IR אחד או יותר (IR8a, IR25a ו- IR76b); קולטני המשב הכימו-סנסורי (GRs), המתפקדים כקומפלקס של שלושה חלבונים לזיהוי פחמן דו-חמצני (CO2)1,2.
RNA fluorescence in situ hybridization הוא כלי רב עוצמה לזיהוי ביטוי של mRNA אנדוגני3. באופן כללי, שיטה זו משתמשת בבדיקת חומצת גרעין חד-גדילית עם תיוג פלואורופור עם רצף משלים ל-mRNA מטרה. קשירה של גשושית הרנ”א הפלואורסצנטי לרנ”א המטרה מאפשרת זיהוי תאים המביעים תעתיק עניין. ההתקדמות האחרונה מאפשרת כעת זיהוי תמלילים ברקמות יתוש שלמות 4,5. הדור הראשון של טכנולוגיית תגובת שרשרת הכלאה (HCR) השתמש במגבר HCR מבוסס RNA; זה השתפר בשיטת הדור השני שבמקום זאת השתמשה בדנ”א מהונדס עבור מגבר HCR 6,7. שדרוג זה הביא לעלייה של פי 10 בסיגנל, ירידה דרמטית בעלות הייצור ושיפור משמעותי בעמידות של ריאגנטים 6,7.
בפרוטוקול אנו מתארים את השימוש בשיטת הדור השלישי של HCR להכלאה מלאה של RNA באתרו (HCR RNA WM-FISH) המיועדת לאיתור לוקליזציה מרחבית וביטוי של כל גן 8,9. שיטה דו-שלבית זו משתמשת תחילה בבדיקות חומצות גרעין ספציפיות ל-mRNA המעניין, אך מכילות גם רצף זיהוי יוזם; השלב השני משתמש בסיכות ראש עם תיוג פלואורופור שנקשרות לרצף היוזם כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי (איור 1). שיטה זו מאפשרת גם ריבוב של שתי בדיקות RNA או יותר והגברת אותות בדיקה כדי להקל על זיהוי וכימות RNA8. הדמיה של שפע התעתיק ודפוסי לוקליזציה של RNA של גנים כימו-סנסוריים המתבטאים בתוספות הריח מציעה את הקו הראשון של תובנה לגבי תפקודי גנים כימו-סנסוריים וקידוד ריח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור השלישי של תגובת שרשרת הכלאה (HCR) יוצא דופן ברגישותו ובחוסנו כדי לדמיין מספר מטרות RNA8. HCR WM-FISH שימש בהצלחה על עוברים של דרוזופילה, תרנגולות, עכברים ודגי זברה, כמו גם על זחלים של נמטודות ודגי זברה 10,16,17. אנטנות יתושים ומיש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרגו הררה ולמעבדת לסלי וושל על שיתוף פרוטוקול ההכלאה באתרם עבור נספחי ריח Aedes aegypti . עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ל- C.J.P. (NIAID R01Al137078), מלגת HHMI חנה גריי ל- J.I.R, פרס מאיץ פוסט-דוקטורט של ג’ונס הופקינס ל- J.I.R, ומלגת פוסט-דוקטורט של מכון ג’ונס הופקינס לחקר המלריה ל- J.I.R. אנו מודים למכון לחקר המלריה בג’ונס הופקינס ולקרן בלומברג על תמיכתם.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
Referências
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
